DNA堿基編輯工具的進步為疾病治療帶來了巨大的希望，可修複由單核苷酸多态性(SNPs)【1】引起的單基因遺傳疾病。目前，胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器主要依靠脫氨酶将胞嘧啶 (C) 或腺嘌呤 (A) 轉化為尿嘧啶 (U) 或肌苷 (I)，脫氨後的U和I會分别被識别為胸腺嘧啶 (T) 和鳥嘌呤 (G)，從而促進C-to-T和A-to-G堿基變化【2-4】。在此基礎上，進一步引入DNA糖基化酶切割中間産物U或I，産生無尿嘧啶/無嘧啶位點(AP位點)，可以實現堿基的颠換，包括C-to-G轉換的CGBE【5、6】和A-to-T/C轉換的AYBE【7、8】。但以上堿基編輯工具均依賴脫氨酶，限制了它們編輯T和G的能力，并且由于脫氨酶的過表達會引起一定的脫靶效應。

2024年7月30日，北京大學魏文勝課題組在Nature Communications雜志在線發表題為 “Programmable DNA pyrimidine base editing via engineered uracil-DNA glycosylase”的研究論文，報道了一種名為TBE (Thymine base editor) 的不依賴脫氨酶的DNA堿基編輯工具。與現存的其他胸腺嘧啶編輯工具相比，TBE表現出更高的編輯效率、更小的細胞毒性和更低的脫靶現象。

圖1: 不依賴于脫氨酶的堿基編輯器

研究人員關注到人源化尿嘧啶DNA-糖基化酶 (hUNG) 的兩個突變體可以在體外實現對胞嘧啶和胸腺嘧啶的直接切割【10】。因此，通過将hUNG突變體與Cas9蛋白結合，sgRNA靶向編輯位點可以在體内實現對DNA序列中的C和T的直接編輯 (圖1)，其中在報告系統上編輯C的效率可達到30%，與現存的CGBE編輯效率類似，但針對T的hUNG突變體編輯效率較低。

為了進一步提高胸腺嘧啶的編輯效率，研究人員通過對UNG結構理性設計、同源蛋白檢索、定向進化篩選的策略找到了來自耐輻射奇球菌 (Deinococcus radiodurans) 的尿嘧啶DNA-糖基化酶 (DrUNG) 突變體可以在多個人類基因組位點上實現高效的胸腺嘧啶編輯 (圖2)，編輯結果顯示平均T-to-C, T-to-G及T-to-A的比例為52%, 30%和18%。通過優化連接氨基酸、引入具有合成傾向性的DNA聚合酶，還可以進一步提高編輯效率與編輯純度。全面評估顯示，TBE在基因組或轉錄組水平上都不會導緻嚴重的脫靶編輯，這表明其具有高度的編輯特異性。

圖2: TBEs在人類基因組多個内源位點實現高效的編輯

近期，多個團隊也報道了基于人源化糖基化酶的胸腺嘧啶堿基編輯器【11-12】。通過比較32個内源位點編輯結果，研究人員發現與基于人源的胸腺嘧啶堿基編輯器相比，TBE展現出更高的編輯效率。此外，細胞毒性實驗也表明TBE具有更小的細胞毒性。

最後，通過将DrUNG突變體的mRNA與nickase SpCas9融合蛋白和sgRNA共轉染到原代成纖維細胞中的α-L-艾杜糖醛酸酶缺陷細胞中，可以觀察到該酶活性的恢複，證明了TBEs在相關疾病治療方面的潛在應用前景。

北京大學/昌平實驗室魏文勝課題組博士後伊宗裔、博士後張小雪、博士研究生魏曉旭、本科生李佳怡（2024級研究生新生）為論文的共同第一作者。本研究獲得了國家自然科學基金，昌平實驗室，北大-清華生命科學中心及中國博士後科學基金資助。

文章鍊接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-50012-w

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