越來越多表觀、代謝相關的酶在不同的生命過程中呈現了非經典的兼職功能（Moonlighting functions）。RNA聚合酶的經典功能是依據DNA模闆生成RNA，但是RNA聚合酶除了RNA生成之外的非經典功能卻知之甚少。RNA聚合酶亞基的變異或者異常表達和不同組織的疾病密切相關，表明亞基自身的功能重要。先前的常規幹擾手段如RNA幹擾、基因敲除等需要較長時間，會産生大量二級效應，因而很難确定RNA聚合酶的非經典功能。

2023年3月15日，beat365官方网站、北大-清華生命科學聯合中心季雄課題組在Molecular Cell雜志在線發表了題為“RNA Pol II preferentially regulates ribosomal protein expression by trapping disassociated subunits”的研究論文。該研究報道了RNA聚合酶亞基RPB3能夠通過CBC-PCF11和小延伸複合物特異性調控核糖體蛋白基因的3’末端加工的非經典兼職功能機制，表明RNA聚合酶可以通過遊離組分實現單功能酶到多功能酶的轉變，把不同的活性限制在全酶附近增加了基因表達效率，并且實現特異性調控。同時該研究提出的SDDS系統為其它複合體亞基的非經典兼職功能研究提供了新工具。該工作被Molecular Cell雜志在同期“Meet the authors”專欄作為研究亮點采訪報道。

研究者首先利用染色質組分的分子篩實驗在多種哺乳動物細胞系中均檢測到獨立于Pol II全酶的RPB3，稱為disassociated RPB3(dRPB3)。随後研究者設計了一種巧妙的策略-Specific Degradation of Dissociated Subunits，簡稱SDDS系統，該系統在RPB3 degron細胞的基礎上，将偶聯linker區的RPB3整合到内源RPB1的終止密碼子前，得到純合的RPB1-linker-RPB3融合蛋白表達細胞，稱為dRPB3 degron細胞。理論上RPB3 degron細胞在化學分子吲哚乙酸（IAA）處理後可降解細胞内全部RPB3，而dRPB3 degron細胞在IAA處理後，全酶中的RPB3可被RPB1偶聯的RPB3替代，維持了全酶的完整性，但會導緻遊離于全酶之外的RPB3被降解。因此通過比較dRPB3 degron細胞IAA處理前後的功能差異，即可闡釋遊離RPB3的功能。

圖1. 遊離RPB3（dRPB3）蛋白瞬時降解系統（SDDS）和RPB3蛋白瞬時降解系統建立。

為了确認SDDS系統是否正常工作，研究者們通過RNA-seq、ChIP-seq、ChIP-Western、IF等實驗對dRPB3 degron細胞進行了多個層面的質量控制，結果顯示在RPB1末端偶聯linker-RPB3不影響Pol II全酶的功能，也不幹擾對RPB1的蛋白互作和定位。RPB3 degron細胞在IAA處理後可導緻RPB1與多種小亞基相互作用的減少，然而dRPB3 degron細胞在IAA處理後并不影響RPB1與小亞基的相互作用。同時搭配AlphaFold2的蛋白結構預測，研究者認為dRPB3 degron細胞在IAA處理後，正如所設想的方式，僅造成遊離RPB3降解，全酶中的RPB3可被偶聯于RPB1末端的RPB3所代償，維持了全酶功能的完整性。

随後，研究者們開展了dRPB3、RPB3降解前後的RNA-seq、ChAR-seq實驗分析，結果顯示不同于RPB3降解後造成的部分基因表達下調，dRPB3的降解對基因表達幅度影響較小，但卻可導緻特異的RNA剪接錯誤和3’末端加工障礙，表明dRPB3參與轉錄後調控。更有意思的是RNA 3’末端加工障礙特異性富集在核糖體蛋白基因。代表新生轉錄組的TT-seq實驗進一步證明dRPB3參與調控核糖體蛋白基因的RNA 3’末端加工。

圖2. dRPB3瞬時降解造成特異性核糖體蛋白的3’末端加工障礙。

為了探究dRPB3調控RNA 3’末端加工的分子機制，研究者根據ChIP-MS、ChIP-Western、ChIP-qPCR等實驗，發現遊離RPB3可招募NCBP1、PCIF1、PCF11到Pol II 全酶附近，幫助維持各蛋白與Pol II全酶的互作，确保了轉錄的正常終止。随後研究者通過蛋白結構域基序分析，證明隻保留RPB3前137個氨基酸的顯性負調控突變體—RPB3-N137，在不能組裝進Pol II全酶的前提下，依然能夠與NCBP1互作，而表達該突變體同樣造成内源核糖體蛋白基因的3’末端加工障礙。更進一步地，研究者利用雙熒光素酶報告系統檢測了遊離RPB3對核糖體相關蛋白基因的轉錄終止調控作用，同樣發現遊離RPB3對基因轉錄終止的調控具有核糖體蛋白基因特異性，并且依賴于PCF11及其識别的轉錄終止基序。這些結果證實了遊離RPB3對于核糖體基因轉錄終止的調控作用。

為了探究遊離RPB3調控核糖體基因特異性的機制，研究者通過機器學習算法，發現dRPB3特異性影響3’末端加工的基因可以被LEC (Little Elongation Complex) 小延伸複合物組分ELL2、AFF4在這些基因啟動子區域的DNA結合水平解釋，而這兩者參與形成的小延伸複合物，先前被報道調控基因的3’末端加工。通過Co-IP和體外pulldown實驗，研究者認為遊離RPB3同樣招募ELL2，協助LEC複合物調控Pol II 全酶。 另外研究者們在體外相分離實驗中發現Pol II CTD形成的液滴可招募遊離RPB3在其液滴外表面。因此研究者提出: 高水平的核糖體相關蛋白基因的轉錄導緻Pol II轉錄工廠中的Pol II CTD捕獲遊離RPB3，從而提高基因表達效率，提供了調控的特異性。

圖3. RPB3特異性調控核糖體蛋白基因3’末端加工的機制模型。

總體而言，該工作揭示了RPB3以獨立于Pol II全酶，調控核糖體相關蛋白基因表達的新的模式，同時文章設計的SDDS系統對于研究其他多亞基複合物中具有非經典兼職功能的亞基蛋白提供了新的策略。

圖4. 圖中代表雙子座（Gemini)。圖像中間是阿喀琉斯之盾，盾的中心是時間之神，邊緣是十二星座，代表12個亞基組成的RNA聚合酶II。第三個星座是雙子座, 正面對着我們的是哥哥(RPB3)。背對着我們的是弟弟(dRPB3), 弟弟不常露面，被阿喀琉斯之盾（Pol II）困住（Trapping）。

beat365官方网站、北大-清華生命科學聯合中心季雄研究員是該論文的通訊作者。beat365李圓君博士、黃捷博士，博士研究生包麗君、朱峻毅、段文嘉是該論文的共同第一作者。beat365官方网站伊成器課題組、中科院生物物理所俞洋課題組為該工作提供了重要幫助。該工作得到北大-清華生命科學聯合中心、啟東創新基金、細胞增殖與分化教育部重點實驗室、科技部國家重點研發計劃和國家自然科學基金的資助。感謝北京大學鳳凰工程多個儀器平台對本項目的大力支持。

季雄課題組長期從事RNA聚合酶亞基功能調控和疾病機理的研究。主要集中在RNA聚合酶相關的非經典功能調控、疾病和分子探針等方向，近期成果發表在Cell、Molecular Cell（2）、Genome Biology（2）、Nature Communications、Cell Discovery、CMLS和iScience等雜志上，為選擇性基因表達調控提供新的假說。現因發展需要，招聘博士後2-3名。

原文鍊接：https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(23)00155-7

論文作者從左至右：黃捷、朱峻毅、季雄、段文嘉、李圓君、包麗君