cGAS-STING通路是負責識别胞質DNA免疫應答的主要通路 ¹。cGAS作為胞質DNA受體，可以被DNA和/或Mn²⁺ 激活并利用ATP和GTP合成第二信使2’3’-cGAMP，後者進一步激活STING并誘導I型幹擾素等細胞因子的産生，從而介導抗感染/腫瘤免疫反應。研究表明多種病原微生物入侵及各種壓力脅迫，如氧化應激、代謝紊亂及DNA損傷等都可導緻胞質DNA的累積及Mn²⁺ 濃度的升高，從而激活cGAS-STING通路。因此，cGAS-STING信号通路在抵抗病原微生物感染、腫瘤及多種免疫相關疾病的發生及治療中都發揮關鍵作用。

磷脂酰肌醇磷酸（phosphoinositides, PIPs）是構成真核生物細胞膜組分的重要磷脂（占總磷脂的5-10%），也是重要的信号分子 ²。由于肌醇六元環上D-3，D-4或D-5位都可發生磷酸化修飾，因此真核生物中總共存在7種不同PIP分子。PI4P（phosphatydyinositol 4-phosphate）是胞内含量最高的PIP分子，廣泛分布于各種膜組分，且在反式高爾基體（trans-Golgi network, TGN）上的含量最高。細胞中的PI4P的含量主要受其合成酶PI4Ks (PI4KA, PI4KB, PI4K2A和PI4K2B)和降解酶SAC1的調控。PI4P不僅是合成PIP2和PIP3的前體，也是重要的信号分子，在膜泡運輸、脂質轉運和細胞器形态維持等方面發揮關鍵作用。

2021年蔣争凡實驗室利用STING自激活突變體誘導細胞死亡的特性，在HT080細胞中進行了基于CRISPR-Cas9介導的全基因組篩選，發現高爾基體腔内合成的硫酸化糖胺聚糖（sGAGs）可以通過結合到STING跨膜區的腔内側，從而誘導STING的寡聚及激活 ³。該論文的讨論部分提到STING和sGAGs的相互作用受到STING腔内側pH值的調控，并由此推測STING在pH更低的後高爾基體囊泡（post-Golgi vesicles）中會有更高的活性。但是在這個研究中，他們沒有解釋STING為什麼需要及如何轉運到後高爾基體囊泡。

2023年3月14日，beat365官方网站蔣争凡實驗室在《Immunity》上以research article形式在線發表了“ARMH3-mediated recruitment of PI4KB directs Golgi-to-endosome trafficking and activation of the antiviral effector STING”，報道了ARMH3作為接頭蛋白招募PI4KB到STING，PI4KB通過合成PI4P促進STING從高爾基體到内體的轉運（Golgi-to-endosome trafficking）及維持STING激活所需要的脂膜環境（lipid environment），從而幫助STING更加穩定高效的激活。

本工作首先通過CRISPR-Cas9介導的全基因組篩選在HeLa細胞系中鑒定到一個未知功能的新基因C10ORF76 (又名ARMH3)對STING的激活十分重要（圖一A）。ARMH3是一個鮮少被研究的蛋白，為數不多的幾篇文章暗示了它對于PI4KB發揮激酶活性來磷酸化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）生成PI4P十分重要。免疫熒光實驗發現STING激活後和ARMH3，PI4KB及PI4P都在反式高爾基體有明顯的共定位。進一步免疫共沉澱實驗顯示，STING隻有在ARMH3存在的情況下和PI4KB有互作（圖一B），表明ARMH3在STING和PI4KB之間起到橋梁作用。進一步實驗表明ARMH3分别結合位于STING第二、三跨膜區之間的連接區域及位于PI4KB激酶結構域中間的連接區域。突變掉STING負責結合ARMH3的氨基酸或者利用CRISPR-Cas9原位删除PI4KB與ARMH3互作的關鍵區域（6個氨基酸殘基）都會顯著削弱cGAS-STING通路的激活。這些結果表明ARMH3招募PI4KB對于STING的激活十分關鍵。更重要的是，細胞内敲除ARMH3或者原位删除PI4KB結合ARMH3所需的6個氨基酸，STING在上遊通路活化後幾乎呈現完全的内質網定位，暗示如果2’3-cGAMP結合後被轉運到高爾基體的STING無法被繼續轉運到後高爾基體囊泡，将會被細胞内COPI/AP1介導的從高爾基體向内質網的逆向轉運運回内質網，并完全抑制STING的活化。

為了更直接的研究PI4KB對STING激活的影響，他們使用雷帕黴素誘導的FKBP和FRB相互作用，直接招募PI4KB-GFP-FKBP到STING-mCherry-FRB，并發現招募PI4KB到STING會顯著促進STING聚集體的形成及下遊信号通路的激活（圖一C），且這種對于STING通路的激活能力完全依賴于PI4KB的激酶活性。相反，招募PI4P的磷酸酶SAC1到STING則會抑制STING聚集體的形成及下遊信号通路的激活。表明PI4KB通過在STING周圍合成PI4P促進STING的激活。有趣的是，SAC1的敲低會引起的細胞内PI4P水平的異常升高，進而導緻STING不依賴于cGAS的自激活。TMEM39A是一個自身免疫性疾病相關基因且被報道參與細胞内的PI4P水平的調控 ⁴。同樣，TMEM39A的敲低也會導緻細胞内PI4P的水平的異常升高及STING的自激活，該發現有助于理解TMEM39A相關自身免疫疾病的緻病機制。此外，SCAP 和NPC1的突變也被報道可以引起細胞内PI4P的水平的異常升高及STING的自激活 ^5-8，提示胞内PI4P水平的異常升高可能是這些基因突變導緻STING自激活的共同原因。

為了研究PI4P如何影響STING的激活，他們對23個PI4P結合蛋白進行了系統性地敲低并發現其中9個成員的降低表達會使STING的激活嚴重受損（圖一D）。功能分析表明這9個PI4P結合蛋白可以分為兩類。其中AP-1和GGA2負責介導高爾基體到内體的膜泡運輸。由于内體中相對更低的pH值有利于STING與sGAGs的結合，他們推測PI4P 可以通過指導AP-1和GGA2介導的clathrin-coated vesicles (CCVs) 将STING從高爾基體轉運到内體從而避免STING被運回内質網，并且更加強烈激活STING。另一類PI4P結合蛋白均為脂質轉運蛋白，其中OSBP和ORPs負責從内質網向高爾基體或内體轉運膽固醇，CERT負責神經酰胺從内質網到高爾基體的轉運。神經酰胺在高爾基體上會在SGSM1的催化下轉化為鞘磷脂，且SGSM1在細胞内的敲除會顯著削弱STING的激活，提示鞘磷脂而非神經酰胺直接作用于STING。通過特異的化學小分子破壞膽固醇和鞘磷脂在脂膜上的分布會使STING聚集體逐漸消散并顯著抑制STING下遊信号通路的激活，表明膽固醇和鞘磷脂對STING聚集體的形成和激活十分關鍵。以上結果共同表明PI4P還可以通過脂質轉運蛋白維持STING活化所需的脂膜環境進而影響STING的激活。此外，Lyz-Cre介導的Armh3條件敲除小鼠實驗表明Armh3在機體對抗DNA病毒感染過程中發揮關鍵作用。

綜上所述，該研究發現：1）STING為什麼需要離開及如何離開高爾基體（後高爾基體轉運（post-Golgi trafficking））的分子機制（圖二）；2）一個功能未知蛋白ARMH3（可能還具有GEF活性，激活膜泡轉運中非常重要的Small GTPase Arf1）在cGAS-STING通路中的重要作用；3）脂膜環境對STING的活化十分關鍵；4）細胞内PI4P水平的異常升高可以導緻非依賴于cGAS的STING分子自激活（cGAS-independent STING autoactivation）。重要的是，這種現象在很多脂質代謝紊亂的自身免疫病患者中被發現及報道。鑒于PI4P在脂質運輸及脂質穩态維持中的核心作用，他們的研究還提示STING作為一個潛在的細胞脂質穩态感受器（lipid homeostasis sensor），可能是細胞内的一種新型危險信号感受器。

北京大學生科院博士後方潤和蔣啟飛為該文章的共同第一作者，2022級研究生賈新穎也為本研究做出貢獻。生科院/北大-清華生命科學聯合中心的蔣争凡教授為通訊作者。本研究工作得到了國家自然科學基金委、科技部國家重點基礎研究項目、北京大學“細胞增殖與分化”教育部重點實驗室及“北大-清華生命科學聯合中心”的資助。

原文鍊接：https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.02.004

參考文獻：

1   Fang, R. et al. Recent advances in the activation and regulation of the cGAS-STING pathway. Advances in Immunology 156, 55-102, doi:10.1016 /bs.ai.2022.09.003 (2022).

2   Posor, Y. et al. Phosphoinositides as membrane organizers. Nat Rev Mol Cell Biol, doi:10.1038/s41580-022-00490-x (2022).

3   Fang, R. et al. Golgi apparatus-synthesized sulfated glycosaminoglycans mediate polymerization and activation of the cGAMP sensor STING. Immunity 54, 962-975, doi:10.1016 /j.immuni.2021.03.011 (2021).

4   Miao, G. et al. The ER-Localized Transmembrane Protein TMEM39A/SUSR2 Regulates Autophagy by Controlling the Trafficking of the PtdIns(4)P Phosphatase SAC1. Mol Cell 77, 618-632 e615, doi:10.1016/j.molcel.2019.10.035 (2020).

5   Wakana, Y. et al. The ER cholesterol sensor SCAP promotes CARTS biogenesis at ER-Golgi membrane contact sites. J Cell Biol 220, doi:10.1083/jcb.202002150 (2021).

6   Kutchukian, C. et al. NPC1 regulates the distribution of phosphatidylinositol 4-kinases at Golgi and lysosomal membranes. EMBO J 40, e105990, doi:10.15252/embj.2020105990 (2021).

7   York, G. et al. Limiting Cholesterol Biosynthetic Flux Spontaneously Engages Type I IFN Signaling. Cell 163, 1716-1729, doi:10.1016/j.cell.2015.11.045 (2015).

8   Chu, T. et al. Tonic prime-boost of STING signalling mediates Niemann-Pick disease type C. Nature 596, 570-575, doi:10.1038/s41586-021-03762-2 (2021).