組胺（Histamine，HA）是一種重要的單胺類信号分子，存在于中樞神經系統和外周組織，廣泛地參與免疫、消化和神經信号調控。抗組胺藥物常被用來緩解過敏反應。然而，抗組胺藥物的一大副作用是嗜睡，這引起了科學家對組胺在中樞系統中的功能的關注。在大腦中，組胺能神經元的胞體主要分布于下丘腦結節乳頭體核（Tuberomammillary nucleus, TMN），其神經纖維向全腦廣泛投射；組胺能信号參與睡眠覺醒、學習記憶和攝食等過程。目前，人們對組胺的生理功能及作用機制仍有很多未知，其中一個重要的原因是缺乏靈敏、特異的工具，用于對組胺進行高時空分辨率地監測。

2023年3月15日，北京大學李毓龍實驗室在Neuron雜志在線發表了題為Genetically encoded sensors for measuring histamine release both in vitro and in vivo的研究論文，報道了新型基因編碼的組胺探針GRAB_HA的開發，以及結合新工具對睡眠覺醒過程中的組胺動态調控的研究。

在這項工作中，李毓龍實驗室首先靈活運用GRAB策略（GPCR-Activation Based Sensor）将循環重排的綠色熒光蛋白cpEGFP嫁接到四種人源組胺GPCR受體的第三個胞内環，發現基于H₄R的探針表現出優于其他受體的細胞膜定位特性，後續通過一系列優化，獲得了基于H₄R的組胺熒光探針GRAB_HA1h（簡稱HA1h）。在HEK293T細胞表達的HA1h探針對組胺有~370%的熒光信号響應（ΔF/F₀）和~17 nM的親和力（EC₅₀）（圖1）。為了進一步拓展探針對組胺濃度的檢測範圍，作者篩選了來自于不同物種的組胺受體，并開發了基于水熊蟲H₁R的組胺熒光探針GRAB_HA1m（簡稱HA1m），HA1m探針對組胺的最大ΔF/F₀ ~590%，EC₅₀ ~380 nM。HA1h和HA1m探針能在亞秒級（~0.3-0.6 s）時間尺度上響應胞外組胺濃度變化，且不與GPCR下遊胞内信号偶聯；進一步研究發現HA1h和HA1m探針隻會響應組胺，而對組胺的前體、組胺代謝産物和其它神經遞質均不響應，并且組胺引發的信号能夠被相應受體的拮抗劑阻斷，這說明探針保留了相應受體的藥理學特性。

圖1：新型組胺探針的刻畫。

A, 組胺探針工作原理。B, 組胺探針HA1h、HA1m和HA1mut在HEK293T細胞上的表達及對組胺的反應。

C, 組胺探針對飽和濃度組胺的響應曲線。D, 組胺探針HA1h和HA1m對不同濃度組胺的信号響應。

組胺探針是否能夠檢測内源組胺的釋放？作者借助AAV病毒将HA1m探針表達在小鼠的前額葉皮層（Prefrontal cortex, PFC），制備急性腦切片後使用雙光子成像成功地記錄到了電刺激引起的組胺秒級釋放。此外，作者還實時地觀察到組胺信号從刺激位置向外的擴散。因此，HA1m組胺探針可以實現對内源組胺釋放的高時空分辨率檢測。

組胺探針是否能夠應用于活體動物中？組胺是調控睡眠覺醒的重要分子，視前區（Preoptic area, POA）是參與睡眠覺醒調控重要的腦區，且接收組胺能神經元密集的投射。作者首先利用AAV病毒将HA1m探針表達在小鼠的視前區，通過光纖記錄探針的熒光信号，同時記錄小鼠腦電和肌電以判斷睡眠狀态。作者發現在小鼠快速眼動（REM）睡眠向覺醒轉換和非快速眼動（NREM）睡眠向覺醒轉換過程中組胺信号升高，在覺醒向NREM睡眠轉換和NREM睡眠向REM睡眠轉換過程中組胺信号下降。作為對照，利用突變失活型探針觀察不到明顯的信号變化，說明信号檢測的特異性。進一步的，作者在組胺合成酶敲除（HDC KO）的小鼠中發現HA1m探針信号也沒有明顯變化。綜上所述，HA1m探針能夠實現在活體小鼠中對組胺動态變化進行可靠地、特異地、實時地檢測。

圖2：不同核團組胺動态變化動力學在睡眠時相轉換過程中存在差異。

A, 探針表達和記錄示意圖。B, HA1h探針在PFC和POA的動态變化曲線。

組胺神經元胞體位于下丘腦結節乳頭體核，并向全腦發出廣泛投射。那麼，組胺在不同腦區的動态變化模式是否一緻？作者将HA1h探針表達在小鼠的視前區和前額葉皮層，同時記錄了這兩個腦區的組胺在睡眠覺醒中的動态變化（圖2）。結果發現，兩個腦區組胺探針信号大小在相同睡眠時相時是一緻的。有趣的是，在REM睡眠向覺醒轉換、NREM睡眠向覺醒轉換和覺醒向NREM睡眠轉換過程中，視前區的組胺變化動力學比前額葉皮層更快，這提示了組胺在不同腦區中存在不同的調控模式。總之，利用新開發的組胺探針，作者發現不同腦區的組胺動力學存在差異，為研究組胺的功能提供了重要的啟示。

在中樞神經系統中，除了本項工作研究的睡眠覺醒調控外，組胺還參與其它的生理和病理過程，包括攝食、運動、認知、癫痫和偏頭痛等。在外周系統中，組胺還參與過敏反應、瘙癢和胃酸分泌等過程。新型的組胺熒光探針将會成為研究組胺參與的功能和其調控機制的有力工具。

圖形摘要：組胺熒光探針GRAB_HA的工作原理及離體和在體應用。

beat365官方网站博士後董輝和博士生李夢堯（已畢業）為本文共同第一作者，李毓龍教授為通訊作者，實驗室成員鄢羽岐、錢統瑞、林雲緻、劉燦、李國川和王歡對文章做出了重要貢獻。該工作得到了阿姆斯特丹自由大學（Vrije Universiteit Amsterdam） Rob Leurs教授及其團隊Xiaoyuan Ma和Henry F. Vischer的通力合作，以及浙江中醫藥大學/浙江大學陳忠教授團隊和複旦大學中山醫院楊向東教授團隊的大力支持。該工作得到了北京大學膜生物學國家重點實驗室、北大-清華生命科學聯合中心、國家自然科學基金、北京市科委、生命醫學峰基金和宋晨楓與高欣欣公益基金會等機構、經費和項目的大力支持。

更多李毓龍實驗室工作詳見：http://yulonglilab.org/。此外，李毓龍實驗室誠聘不同學科背景的副研究員、博士後及技術員，待遇從優。歡迎對腦科學感興趣的有志青年加入！

原文鍊接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2023.02.024