膜蛋白約占細胞蛋白質總數的四分之一，是生物膜的重要組成部分，廣泛參與各種生命活動。膜蛋白的生物合成和折疊對細胞功能至關重要，其功能障礙與諸多人類疾病息息相關。由于膜蛋白獨特的疏水性，其合成過程受到高度調控，确保膜蛋白的新生肽鍊能夠高效地從細胞質運輸進入脂膜，并正确折疊成為有功能的膜蛋白。Sec複合物（Sec translocon）作為最重要的膜蛋白轉位機器，控制絕大多數膜蛋白的入膜通路，因此也被稱為“膜蛋白之母”。Sec轉位複合物的序列和功能高度保守，早在八十年代就通過遺傳篩選被鑒定出來，原核細胞中定位在細胞質膜，被命名為SecY；真核細胞中定位在内質網膜，被命名為Sec61。在之後的幾十年裡，領域内對SecY/Sec61介導的蛋白轉位機制進行了持續、廣泛和深入的研究，形成了Sec複合物以門控通道的形式幫助膜蛋白進入細胞膜的共識。在轉位過程中，細胞質中的核糖體與膜上的Sec結合，正在被合成的膜蛋白新生肽鍊出核糖體後立即進入Sec通道，然後被釋放進入磷脂雙分子層形成正确折疊的膜蛋白。然而在這一過程中，新生肽鍊的多次跨膜片段的順序轉位機制一直很不清楚，肽鍊運動與折疊的空間和時序關系一直困擾科學界：疏水的跨膜片段如何穿過狹窄的親水通道并正确折疊？解開這些謎題的難點在于蛋白轉位是一個瞬時且高度動态的過程。如何讓蛋白轉位運動慢下來便于深入研究呢？beat365官方网站李龍課題組長期緻力于研究蛋白質轉位的分子過程，重點發展技術平台，綜合利用化學生物學、生物化學、生物物理和遺傳篩選等技術手段捕獲蛋白質轉位運動的瞬時中間狀态，在分子層面揭示蛋白轉位過程的動态全貌。

2025年2月19日，李龍課題組與北京大學前沿交叉學科研究院定量生物學中心宋晨課題組及beat365高甯課題組合作，在Cell期刊上發表了題為“SecY translocon chaperones protein folding during membrane protein insertion”的研究論文。該論文捕獲了膜蛋白轉位過程中的一系列中間狀态，揭示Sec轉位複合物在膜蛋白轉運過程中不僅提供蛋白質穿膜的通道，更扮演“分子伴侶”的重要角色。研究結果第一次在分子水平揭示了膜蛋白轉位與折疊的關系，提出“共轉位折疊”的概念，為理解膜蛋白的生物合成提供了新的研究方向。

為了捕獲膜蛋白轉位的中間狀态，李龍課題組在細胞内建立了蛋白轉位複合物的組裝體系，篩選合适的跨膜螺旋片段作為底物，利用綠色熒光蛋白（GFP）阻滞蛋白轉位過程，同時通過引入二硫鍵交聯、納米抗體、以及納米脂盤等技術穩定膜蛋白轉位的中間态。與高甯課題組合作，利用冷凍電子顯微鏡技術，首次獲得了跨膜蛋白轉運中間态的高分辨率結構。結果顯示，底物的第一個跨膜片段位于SecY通道外，以螺旋的形式插入脂質中，從外部打開SecY通道的側門。第二個跨膜片段位于通道中，前半段呈現去折疊的展開狀态；後半段在通道中以螺旋形式存在，代表在轉位後期的折疊狀态。宋晨課題組在此基礎上系統性地利用分子動力學模拟，進一步證明了SecY通道前半段（細胞質腔）和後半段（細胞外腔）的結構分别為促進跨膜片段的展開和折疊創造了兩種截然不同的物理化學環境，為SecY的“分子伴侶”功能提供了直接物質基礎。更有趣的是，在兩腔之間的孔環區域，底物肽段呈現伸展的螺旋狀和鋸齒狀構象，這種展開的構象可幫助多肽底物通過狹窄的中心孔環。上述結果揭示了SecY在轉位過程中對膜蛋白底物實施的“去折疊助運動”，以及“促折疊助釋放”的精巧策略。

研究進一步以細菌視紫紅質HmBRI為跨膜底物，捕獲該膜蛋白在順序轉位過程中，第三個及第七個跨膜片段進入細胞膜的轉位中間體。結果發現在SecY轉位通道外側與脂膜的交界面上存在一個 “親水凹槽”，由數個高度保守的親水氨基酸組成。由于該親水凹槽深入疏水的脂膜，造成局部磷脂雙分子層的變薄和破壞，為那些已經從通道釋放，但是還未折疊的底物跨膜區段創造穩定環境。全新設計的蛋白轉位雙熒光報告實驗和蛋白質組學分析表明，破壞該親水凹槽導緻膜蛋白在細胞水平出現全局性折疊缺陷，進一步證實SecY通道在膜蛋白折疊過程中的重要性。

圖1 Sec複合物促進膜蛋白的跨膜及正确折疊

圖左部為細胞内SecY介導的膜蛋白轉位示意圖；上部為放大的膜蛋白轉位中間态示意圖；下圖為膜蛋白轉位過程中SecY及膜蛋白底物局部細節圖，紅色虛線圈注SecY作為“分子伴侶”幫助膜蛋白底物入膜折疊的關鍵位點。

綜上所述，這一系列實驗結果揭示了Sec轉運複合物前所未知的精妙組織方式，改寫了對Sec功能的傳統認知，提出Sec不僅僅隻是被動的“蛋白通道”，更發揮不可或缺的“分子伴侶”功能，利用多種分子機理幫助膜蛋白入膜折疊。本研究為理解膜蛋白的轉運機制提供了全新視角，并為研究膜蛋白折疊失衡相關的疾病提供了新的思路。

beat365官方网站李龍研究員，高甯教授以及前沿交叉學科研究院定量生物學中心宋晨研究員為該論文通訊作者，2022級生科院博士生歐曉敏，高甯實驗室前博士後馬成英博士，李龍實驗室前技術員孫東傑，李龍實驗室前博士後許金坤和宋晨實驗室前博士後王洋為共同第一作者。2022級生科院博士生吳曉飛，宋晨實驗室前博士生王大力和楊嵩為該研究工作做出了重要貢獻。beat365官方网站昌增益教授對光交聯實驗提供了大力幫助。哈佛醫學院Tom Rapoport教授對論文寫作提供了重要指導。北京大學國家蛋白質科學中心張琪博士、劉棟博士，北京大學醫學部劉小雲研究員在質譜數據收集和分析方面提供了大力幫助。整個研究過程也得到了很多國内同行的熱心指導和支持。該研究工作得到北京大學冷凍電鏡平台、高性能計算中心、生科院儀器中心、國家鳳凰蛋白質平台以及北極星等超算平台的支持。該研究得到了國家自然科學基金、國家重點研發計劃以及中國博士後科學基金的資助。

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