2024年11月22日，beat365官方网站、北大-清華生命科學聯合中心、核糖核酸北京研究中心高甯課題組在The EMBO Journal發表了題為Structural insight into Okazaki fragment maturation mediated by PCNA-bound FEN1 and RNaseH2的研究論文，對含有PCNA的内源相關複合物進行結構研究，獲得了兩組PCNA複合物（PCNA-FEN1、PCNA-FEN1-RNaseH2）的結構，為理解岡崎片段成熟的後期步驟提供了一系列的結構快照。

真核生物DNA複制在複雜的染色質環境下進行，與多種分子生物學過程互相協調，例如DNA複制與修複的偶聯以及DNA複制與新生核小體組裝的偶聯等。PCNA（Proliferating cell nuclear antigen）作為DNA複制體不可缺少的輔助蛋白，在DNA複制中結合各種DNA聚合酶以賦予其持續合成的能力，也可以将多種因子募集到DNA複制、修複等DNA代謝事件發生的位點，并促進相應的生物學反應，是DNA代謝的中心樞紐之一。與PCNA相互作用的蛋白超過兩百多種，包括DNA複制相關蛋白（Pol δ、Pol ε、Pol η、Pol κ、FEN1、LIG1等）、解旋酶（WRN、BLM、RECQ5等）、DNA修複蛋白（MSH3、MSH6、XPG、FANCM等）、表觀遺傳因子（CAF-1、DNMT1、p300、HDAC1等）及參與細胞周期調控、凋亡等過程的一些蛋白分子，它們都是通過自身保守的PIP box（PCNA-interacting protein box）或PIP-like 基序結合PCNA。

真核生物PCNA是環繞雙鍊DNA的同源三聚體，每個單體都包含一個PIP box結合位點，因此一個PCNA環可以至多結合三個含有PIP box的蛋白因子。領域内認為PCNA的協調功能是通過“工具帶，toolbelt”的形式實現，即PCNA同時結合處于上下遊過程的不同的酶，以提高DNA代謝相關事件的整體效率。一個具有代表性的例子是DNA複制過程中的滞後鍊岡崎片段的加工成熟，參與這一過程的所有具有催化活性的酶都與PCNA有相互作用，包括Pol δ、RNaseH2、FEN1、EXO1、PIF1、DNA2以及LIG1。參與引物去除的主要因子是Pol δ、RNaseH2和FEN1，RNaseH2作為RNA核酸酶去除由Pol α與引物酶複合物所合成的RNA-DNA引物中的RNA；DNA聚合酶Pol δ在完成滞後鍊上的新生DNA鍊的延伸之後，會進行鍊置換反應，繼續向前合成将臨近岡崎片段中的引物頂起，形成5'-flap DNA結構；FEN1作為結構特異性的DNA核酸内切酶結合并切割5'-flap DNA；通過這一系列步驟，保真度較差的DNA引物及RNA引物得以去除。領域前期通過體外重組的方式，已經獲得了PCNA-FEN1-Pol δ、PCNA-FEN1-LIG1複合物，對它們的結構和功能進行了表征，部分地驗證了PCNA作為工具帶的分子角色。然而很多重要的機制性的問題還未得到解答，例如PCNA如何特異性地選擇并協調參與同一DNA代謝事件的不同蛋白因子；同時結合在PCNA上的蛋白因子之間是否進行相互的變構調節等。

課題組以PCNA作為誘餌蛋白，首先建立了一套從染色質中快速純化PCNA内源複合物的方法，得到了一系列含有PCNA且參與DNA複制、核小體組裝、DNA修複等過程的内源複合物。

圖1 PCNA内源相關複合物的獲得

結合冷凍電鏡單顆粒三維重構技術解析了兩套複合物PCNA-FEN1與PCNA-FEN1-RNaseH2不同狀态的三維結構。其中PCNA-FEN1複合物中FEN1處于催化後狀态，5'-flap DNA被切割但尚未離開FEN1的酶活中心，表明FEN1的5'-flap DNA産物釋放在細胞内是限速步驟。

圖2 PCNA-FEN1複合物中5'-flap DNA已被酶切

在PCNA-FEN1-RNaseH2複合物中，發現FEN1與RNaseH2分别結合PCNA的不同亞基，證實了PCNA工具帶的功能。對不同狀态的PCNA-FEN1-RNaseH2複合物進行結構分析，發現RNaseH2始終結合在FEN1催化位點上遊固定的雙鍊DNA區域，并且此區域不包含任何未去除的RNA殘基，這表明同時結合PCNA的FEN1與RNaseH2存在一種未被認識到的功能上的耦合。因為5'-flap DNA是聚合酶Pol δ繼續向前合成進行鍊置換的産物，其核苷酸序列與其上遊雙鍊DNA序列一緻，所以在細胞中5'-flap DNA很可能侵入上遊的雙鍊DNA，産生3'-flap DNA，一旦3'-flap長度大于1 nt，FEN1将無法切割5'-flap DNA。然而，當RNaseH2結合在5'-flap DNA上遊雙鍊DNA時，由于空間位阻的存在，5'-flap DNA無法進行鍊入侵，大幅降低了5'-flap DNA轉化形成3'-flap DNA的概率，因此RNaseH2可能通過維持DNA底物的特定構象以促進FEN1 5'-flap DNA的酶切效率。

圖3 人源PCNA-FEN1-RNase H2複合物結構

此外，結構分析表明在PCNA-FEN1-RNaseH2複合物中RNaseH2蛋白通過RNaseH2A亞基結合PCNA，而不是之前報道的RNaseH2B PIP box結合PCNA，序列分析鑒定到RNaseH2A亞基中一個新的PIP box，通過體外生化實驗驗證了RNaseH2A及RNaseH2B亞基的PIP box都可以結合PCNA。結合免疫熒光電鏡的成像實驗，表明RNaseH2A PIP box與RNaseH2B PIP box在不同的生理學過程中發揮功能。

本研究表明PCNA在細胞内可以作為工具帶同時結合多個蛋白因子。之前的模型認為同時結合PCNA的蛋白是按照順序發揮功能，一個酶發揮完功能後與DNA解離，釋放出DNA底物以供另一個酶結合；與之前的模型不同，在PCNA-FEN1-RNaseH2複合物結構中，FEN1與RNaseH2穩定結合同一個DNA底物，RNaseH2可能通過對底物DNA的構象調控來促進FEN1的酶切效率。這表明細胞内同時結合PCNA的不同蛋白因子間可能會對它們酶促反應動力學進行互相調控。RNaseH2除了作為RNA核酸酶參與岡崎片段引物RNA的去除外，本研究發現了RNaseH2的另一個可能的新功能，即以不依賴于核酸酶活性的形式作為雙鍊DNA結合蛋白來調節FEN1的5'-flap DNA酶切功能。

圖4 RNaseH2在岡崎片段成熟過程中發揮作用的模型

高甯教授為本論文的通訊作者。beat3652020級博士研究生田宇輝為本論文第一作者。beat365研究員李甯甯在實驗方法探究及結構計算方面提供了幫助。beat365李晴教授為該論文提供了支持與幫助。本研究得到了國家自然科學基金和昌平實驗室的支持。北京大學冷凍電鏡平台、昌平實驗室冷凍電鏡平台、北京大學高性能計算平台、beat365儀器中心及國家蛋白質基礎設施（北大分平台）對本項目提供了重要的技術支持。

原文鍊接：https://www.embopress.org/doi/full/10.1038/s44318-024-00296-x

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