真核生物的基因組DNA包裹在染色質中，因此真核DNA複制發生在染色質環境下。染色質的基本結構單位是核小體，由147 bp DNA纏繞的組蛋白八聚體組成，組蛋白多種翻譯後修飾是表觀遺傳信息的承載基礎。DNA複制時染色質打開然後重新建立，使得DNA複制和染色質複制的偶聯，在此過程中親本染色質攜帶的表觀遺傳信息被分配到新合成的子鍊DNA，因此染色質重建也是表觀遺傳信息繼承的基礎，維持基因組和表觀基因組穩定。染色質重建的起始步驟是DNA複制偶聯的核小體組裝，同時也是表觀遺傳信息繼承的關鍵一環，其核心是DNA合成和核小體組裝的偶聯。

堿基配對形成了雙螺旋結構的DNA，兩條鍊的互補性決定了DNA是以半保留的方式進行複制。組成DNA的兩條鍊是反向平行的，因此解螺旋的DNA的兩條單鍊具有方向，一條是5’-3’，另一條鍊是3’-5’，但是DNA聚合酶都是5’-3’方向進行合成的，導緻複制叉上兩條鍊的合成方向相反。由此DNA複制的一條鍊是向複制叉前進的方向連續合成，稱之為前導鍊，而另一條鍊的合成方向和複制叉前進的方向相反，先合成小片段DNA然後連接成完整的DNA分子，這個機制是岡崎夫婦發現的，所以這些短片段稱之為岡崎片段，這條鍊稱之為滞後鍊。滞後鍊岡崎片段合成先是Pol α合成帶有一段RNA的DNA引物，然後發生聚合酶Pol α到 Pol δ的轉換，Pol δ繼續合成岡崎片段。其間Pol δ通過鍊置換反應入侵前一個岡崎片段，将含有RNA的保真度較低引物置換，形成單鍊翹起，進而招募Fen1等核酸酶進行切除被置換的單鍊DNA，産生的缺口被DNA連接酶（酵母中是Cdc9）連接，保障岡崎片段成熟，形成完整連續的滞後鍊DNA。伴随岡崎片段合成，核小體也會迅速組裝，以免DNA暴露。前期Whitehouse和Smith的研究表明，真核生物的岡崎片段大小與核小體DNA和連接DNA的長度相當，且連接位置在核小體近中軸區，提出滞後鍊上核小體可以阻礙Pol δ的行進決定岡崎片段的長度ADDIN EN.CITEADDIN EN.CITE.DATA(1, 2)。由于沒有直接證據，核小體組裝和岡崎片段成熟過程的協同機制尚不明确，李晴課題組發展了電鏡核酸技術，對此機制進行了解析。

2024年8月9日，beat365官方网站、北大-清華生命科學聯合中心李晴課題組在Science Advances發表題為“DNA polymerase δ subunit Pol32 binds histone H3-H4 and couples nucleosome assembly with Okazaki fragment processing”的研究論文，巧妙利用DNA連接酶降解體系，應用電鏡核酸技術觀察酵母細胞中DNA複制叉中間體結構，發現核小體中組蛋白和DNA的相互作用決定了鍊置換的位置，而且DNA聚合酶δ的Pol32亞基在C端有一個組蛋白H3-H4的結合區域，可以直接貢獻于後随鍊上的核小體組裝，揭示了後随鍊上DNA合成和核小體組裝的協同機制。

研究者在芽殖酵母中利用AID（Auxin-induced degradation）系統誘導Cdc9在DNA複制早期快速降解，抑制岡崎片段末端的連接，進而在透射電鏡下觀察DNA複制中間體，發現在超過94%的複制叉上都含有翹起的DNA結構（flap structure），并且這個翹起結構主要集中在其中一條子鍊上，進一步的分析表明有翹起發生在滞後鍊(圖1)。通過測量翹起結構(Flap)的兩個主要特征(圖2)：Flap本身的長度和相鄰Flap的間距，研究者發現，1)在野生型背景下，Flap的長度集中分布在52 nt左右，其長度受到Pol δ的鍊置換活性和Fen1的核酸酶活性調控，而且Flap的長度分布具有13-15 nt的步長，可能是由核小體中周期性組蛋白和DNA相互作用障礙鍊置換合成造成的。2）相鄰Flap的間距與岡崎片段長度相似，集中在190 bp左右。該間距的增大來自于DNA複制偶聯的核小體組裝突變，例如經典組蛋白分子伴侶CAF-1大亞基Cac1的缺失突變（cac1D）以及Mcm2結合組蛋白突變mcm2-3A，兩個突變分别會導緻新合成組蛋白的組裝缺陷和舊組蛋白回收缺陷，這個間距增加到280bp左
右，表明岡崎片段的合成受核小體組裝程度調節。

圖1： 電鏡核酸技術觀察DNA連接酶降解後的複制叉結構。圖示複制泡結構；左圖是Cdc9降解後，右圖是未降解對照。

研究者在Pol δ亞基非催化亞基Pol32缺失突變中觀察到flap間距變大，和上述提到核小體組裝突變cac1D以及mcm2-3A的間距變化類似 (圖2)。研究者進一步通過體内、體外分析直接證明了Pol32的C端可以直接結合組蛋白H3-H4，并通過ReIN-Map方法證明Pol32調節滞後鍊上的核小體組裝。

圖2：翹起結構 (Flap)的兩個特征：Flap的長度 (A)和相鄰Flap的間距(B)。

綜上，李晴課題組應用電鏡核酸技術直接觀察複制叉滞後鍊的分子事件，發現Pol32介導了核小體組裝，進而提供了岡崎片段合成過程中鍊置換的終止位置，為岡崎片段成熟和核小體組裝協同機制提供直接證據(圖3)。

圖3：Pol32介導核小體組裝與岡崎片段成熟協同機制。(i) Pol δ催化岡崎片段合成；(ii) 岡崎片段合成後，通過Pol32快速組裝H3-H4四聚體到新合成的DNA上；(iii) Pol δ侵入先前産生的具有新生核小體的岡崎片段；(iv) 岡崎片段合成的重複循環，形成反應核小體間距的flap間距；在Pol32缺失突變體中，核小體組裝水平下降導緻核小體屏障的減少，進而導緻岡崎片段增長。

北京大學石國君博士、北京大學博士研究生楊超淇、吳佳樂為論文的共同第一作者。北京大學李晴教授和馮建勳副研究員為本文的共同通訊作者。北京大學雷陽博士和胡家志教授為本文的共同作者。感謝北京大學孔道春教授對電鏡核酸技術建議，感謝希望城國家醫學中心貝克曼研究所沈炳輝教授對本工作的讨論，感謝北京大學電鏡平台郝雪梅老師和劉轶群老師的幫助。本研究感謝科技部、國家自然科學基金委、北京市教育委員會、北京大學-清華大學生命科學聯合中心和蛋白質與植物基因研究國家重點實驗室等資助。

原文鍊接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ado1739

參考文獻：

1.   D. J. Smith, I. Whitehouse, Intrinsic coupling of lagging-strand synthesis to chromatin assembly.Nature483, 434-U480 (2012).

2.   N. C. Koussa, D. J. Smith, Post-replicative nick translation occurs on the lagging strand during prolonged depletion of DNA ligase I in.G3-Genes Genom Genet11(2021).