五羟色胺（5-HydroxyTryptamine，5-HT）也被稱作血清素（serotonin），是一種重要的單胺類信号分子，參與多種生理功能的調節。在中樞神經系統中，5-HT信号的失調與多種腦部疾病相關，如抑郁症、焦慮、成瘾、偏頭痛和癫痫等。目前，多種治療精神疾病的藥物靶向5-HT能系統，如5-HT再攝取抑制劑“百憂解”（fluoxetine，氟西汀）已被廣泛用于治療抑郁症。在活體動物中對5-HT動态變化的高時空分辨率檢測對深入理解5-HT能系統在各種生理病理過程中的調控規律具有重要意義。

2024年3月5日，北京大學李毓龍實驗室在Nature Methods雜志在線發表了題為“Improved green and red GRAB sensors for monitoring spatiotemporal serotonin release in vivo”的研究論文，基于GRAB探針策略（GPCR-Activation Based Sensor）成功開發出了全新的紅色5-HT熒光探針和新一代綠色5-HT熒光探針，并通過光纖記錄和大視場成像等方式實現了在活體小鼠多腦區、多行為範式下對5-HT和其它信号的同時檢測。實現了從“看得見”到“看得清、看得多、看得廣”的突破。

待改進的“看得見”：雖然此前已有幾款可遺傳編碼的5-HT綠色探針被報道，一些條件下能夠觀察活體動物中的5-HT動态變化，但是現有探針反應大小（即熒光亮度變化程度）與親和力（即與配體的結合能力）兩者“魚與熊掌不可兼得”，靈敏度還有待提升。

李毓龍團隊将已有的神經遞質探針中的熒光報告模塊移植到不同5-HT受體亞型中，通過不斷疊代優化開發了新一代的5-HT綠色探針g5-HT3.0和全新的紅色探針r5-HT1.0（圖1）。

圖1. 改進的綠色5-HT探針和全新的紅色5-HT探針的開發與刻畫

為了以更高的靈敏度“看得清”5-HT的動态變化，g5-HT3.0結合了高親和力和高反應兩個優點。體外平行對比實驗表明，相較于親和力較高的g5-HT1.0，g5-HT3.0的最大反應約是它的6倍，同時保持了較高的親和力；相較于反應較大的iSeroSnFR，g5-HT3.0在親和力方面提升了約13000倍，在納摩爾至毫摩爾數量級的五羟色胺濃度範圍内表現出更大的反應。

為了在神經化學信号種類上“看得多”，r5-HT1.0能與其它綠色熒光探針進行雙色成像，實現了不同信号的同時檢測。本研究在小鼠基底前腦（Basal Forebrain，BF）同時記錄了5-HT能神經元軸突的鈣活動（綠色GCaMP6s）以及軸突釋放的5-HT（紅色r5-HT1.0）的動态變化，發現二者存在很高的相關性（圖2）。

圖2. 光纖雙色記錄基底前腦的5-HT和5-HT能神經元軸突鈣信号

為了在成像區域上“看得廣”，本研究結合大視場熒光成像技術和新的g5-HT3.0探針，實現了大尺度、多腦區的5-HT實時監測。首次在小鼠背側皮層監測到了不同條件下的5-HT釋放特征，，如發現了睡眠覺醒周期存在5-HT水平的動态變化，尤其是非快速眼動睡眠（non-rapid eye movement，NREM）期間的震蕩，而同一時刻不同腦區則展現出相對均一的變化（圖3）。結合雙色成像進一步發現，在癫痫的病理條件下，背側皮層存在着5-HT“波”的傳播，并且5-HT“波”緊随着鈣“波”或者内源大麻素“波”進行傳播。以上結果展現了5-HT在大腦不同狀态下具有空間特異性的調控特征，為深入理解其功能提供了有力的工具。

圖3. 睡眠覺醒周期小鼠背側皮層5-HT的時空動态

視頻1. 小鼠癫痫模型中5-HT和鈣“波”的傳播

視頻2. 小鼠癫痫模型中5-HT和内源大麻素“波”的傳播

綜上，本研究開發了全新的紅色5-HT探針和靈敏度大幅提升的綠色5-HT探針，并且使用這些探針研究了不同生理和病理過程中5-HT的時空動态特征，實現了活體動物中5-HT動态監測的突破——即從“看得見”到“看得清”、“看得多”和“看得廣”，加深了對5-HT能系統的了解。這些探針也将為相關領域的研究提供強有力的工具，進一步推動新的科學發現與見解的産生。

beat365官方网站李毓龍教授為該論文通訊作者；beat365官方网站鄧飛博士（現為深圳灣實驗室分子生理學研究所博士後）和萬金霞博士為共同第一作者。李毓龍課題組董輝博士（現為上海交通大學松江研究院青年研究員）、趙玉琳博士、馮傑思博士、李雪霖博士、李國川、夏西聚、王藝潘、鄭宇、鄢羽岐等對文章做出了重要貢獻。該工作得到了清華大學自動化系謝浩博士、莊超玮博士等的通力合作。研究得到了膜生物學國家重點實驗室、北大-清華生命科學聯合中心、國家自然科學基金、北京市科委、生命醫學峰基金、宋晨楓與高欣欣公益基金會和新基石科學基金會所設立的新基石研究員項目與科學探索獎等機構和經費的大力支持。

原文鍊接：https://www.nature.com/articles/s41592-024-02188-8