黏連蛋白Cohesin介導細胞分裂過程中姐妹染色體的黏連，還參與染色質三維結構的形成和維持¹，對哺乳動物細胞基因組DNA的穩定性有着非常重要的影響。黏連蛋白的失活突變在多種癌症中高頻出現，但前期的研究表明黏連蛋白功能缺失導緻的姐妹染色體黏連錯亂引起的染色體非整倍性可能不是緻癌的主要原因²，這表明黏連蛋白功能缺失導緻基因組不穩定乃至腫瘤發生的分子機制仍待進一步挖掘。

2023年7月27日，beat365官方网站和北大-清華生命科學聯合中心胡家志課題組在Nature Genetics發文揭示了黏連蛋白Cohesin功能缺失導緻緻癌基因突變的分子機制。他們發現黏連蛋白缺失會導緻休眠複制源在S期早期的大量激活，從而幹擾正常的DNA複制時序，進而導緻基因組不穩定性的劇增，從而引起部分緻癌或者抑癌基因的突變。該研究是本課題組轉錄調節DNA複制起始的工作的延續，也拓展了他們對基因組三維結構調節DNA複制而維持基因組穩定性的分子機制的理解，還糾正了領域内早前部分研究認為黏連蛋白失活不影響DNA複制時序的錯誤認識。

為探究黏連蛋白失活的影響，作者在人K562免疫細胞和小鼠胚胎幹細胞中構建了生長素介導的Degron系統，用以快速降解黏連蛋白Cohesin的核心組分之一——RAD21（圖1a）。與之前報道一緻，該系統隻能部分降解RAD21（~70%）。為排除RAD21未降解細胞對實驗結果的幹擾，作者僅分選RAD21徹底降解的細胞用于後續分析（圖1b），而之前的兩項相關研究均未排除這部分細胞的影響，因此對實驗結果造成了幹擾。作者首先采用實驗室前期開發的檢測DNA雙鍊斷裂的高通量測序方法——PEM-seq³進行定量分析（Cell Discovery | 胡家志研究組開發出優化基因編輯和追蹤DNA修複的新方法），發現RAD21缺失将導緻全基因組的DNA斷裂水平提高至原來的3-5倍（圖1c）。這說明黏連蛋白在維持基因組穩定性方面發揮着極為重要的作用。

圖1 RAD21降解造成大量基因組雙鍊斷裂發生。

（a)染色質loop及 Cohesin複合體示意圖。（b）K562細胞中RAD21 AID蛋白降解體系構建與驗證。1#和4#為構建成功的RAD21-mAID-mClover細胞系，簡稱RAD21-mAC。（c）PEM-seq方法從MYC和TP53位點分别檢測RAD21降解後染色體易位頻率。（d）RAD21降解導緻的DSB熱點基因。（e）TCGA數據庫子宮内膜癌樣本中熱點基因與Cohesin蛋白亞基共突變情況。

進一步分析發現RAD21缺失導緻的DNA斷裂富集于147個熱點基因，其中超過三分之一與癌症和其它疾病高度相關（圖1d）。此外，這些熱點損傷基因與黏連蛋白的失活存在顯著共突變的關系（圖1e），這表明黏連蛋白的失活突變可能是相關癌症或疾病發生發展的核心原因之一。通過分析這些DNA損傷的分布位置發現，染色質三維結構的改變和轉錄水平的輕微擾動不是黏連蛋白降解導緻DNA損傷的主要原因。但作者發現RAD21降解導緻的DNA損傷非對稱性地分布于DNA雙鍊，且該非對稱分布與DNA複制過程中後随鍊的關鍵産物——岡崎片段的分布方向一緻（圖2a）。此外，黏連蛋白的降解還導緻DNA複制速率下降且停頓複制叉增多（圖2b, c），這些數據均表明黏連蛋白與DNA複制的穩定有着重要的關系，其缺失可能通過影響DNA複制而導緻基因組不穩定性。目前已知DNA複制是細胞基因組不穩定性最大的來源。作者通過繪制細胞的DNA複制時序，發現黏連蛋白的降解導緻了約30%基因組區域的DNA複制時序提前（圖2d, e），且DNA損傷的熱點基因大多位于DNA複制時序異常的區域（圖2f）。

圖2 RAD21降解導緻複制時序紊亂和複制壓力。

（a）PEM-seq檢測RAD21降解後細胞中染色體易位斷裂位點偏向性與OK-seq相似。（b）RAD21降解導緻複制叉速率減慢。（c）RAD21降解導緻複制叉停頓增加。（d）RAD21降解導緻部分基因組區域複制時序提前。（e）K562細胞基因組中31.6%的區域在RAD21降解後發生複制時序的顯著提前。（f）熱點基因的複制時序變化情況，每個方格表示一個基因，紅色和藍色分别表示複制時序的提早和延遲。

為探究複制時序改變的原因，作者采用了該實驗室前期開發的用于鑒定DNA複制起始的測序方法——NAIL-seq⁴（Genome Biology | 胡家志實驗室揭示轉錄調節DNA複制起始的分子機制），發現RAD21的降解導緻約25%更多的DNA複制源在S期早期被激活（圖3a, b）。這些早期複制起始位點具有經典複制源的特征，為休眠複制源（dormant origins）。這些在早期被異常激活的複制源導緻了DNA複制時序的提前（圖3c）。休眠複制源在正常情況下隻在DNA複制中晚期偶爾起始，隻有在面臨DNA複制壓力時才會大量激活。而休眠複制源在S期早期的提前激活需要消耗更多的複制相關因子，從而引起複制壓力，這可能是RAD21缺失導緻基因組不穩定性的重要原因之一。定點敲除c-MYC基因附近的染色質環的錨點，将導緻染色質環内部作用的減弱，從而引起DNA複制起始在染色質環内部的激活，并進而引起DNA損傷水平的增加（圖3d）。這些數據揭示了Cohesin缺失→DNA複制起始位點增加→DNA複制時序紊亂→DNA損傷水平上升的邏輯關系，為深入理解黏連蛋白Cohesin在DNA複制過程中的功能提供了更多的解釋。

圖3 RAD21降解導緻複制起始位點增加并引起DNA雙鍊斷裂。

（a）RAD21降解後（4#）NAIL-seq檢測到的早期複制起始信号（EdU/HU）和所鑒定的早期複制起始位點（Early replication initiation zones, ERIZs）。 (b)餅圖統計1#和4#RAD21-mAC細胞中RAD21降解後ERIZ信号強度分類和比例。（c）K562中四類ERIZ區域在RAD21未降解和降解的細胞中所處的複制時序密度圖。（d）c-MYC區域染色質環錨定位點的敲除（綠色方塊）造成橙色陰影區域染色質相互作用（q3C-seq）減弱，早期複制起始信号（NAIL-seq）增強和DSB（END-seq）的增加。

beat365、北大清華生命科學聯合中心胡家志研究員為通訊作者。前沿交叉學院2023屆博士畢業生吳錦淳、beat365博士後劉陽博士、beat3652021級博士研究生張丁峥嵘和劉栩豪為共同第一作者。艾晨博士、甘婷婷博士、梁昊昕、郭嶽峰、陳莫晗、尹健行博士、劉懿陽和張微微博士亦有貢獻。該工作得到了科技部、國家自然科學基金、細胞增殖與分化教育部重點實驗室、北大-清華生命科學聯合中心、beat365、beat365儀器平台以及鳳凰中心的大力支持。

原文鍊接：https://rdcu.be/dhUmX

參考文獻：

1. Rao, S.S.P., Huang, S.-C., Glenn St Hilaire, B., Engreitz, J.M., Perez, E.M., Kieffer-Kwon, K.-R., Sanborn, A.L., Johnstone, S.E., Bascom, G.D., Bochkov, I.D., et al. (2017). Cohesin Loss Eliminates All Loop Domains. Cell 171, 305-320.e324.

2. Waldman, T. (2020). Emerging themes in cohesin cancer biology. Nature Reviews Cancer 20, 504-515.

3. Yin, J., Liu, M., Liu, Y., Wu, J., Gan, T., Zhang, W., Li, Y., Zhou, Y., and Hu, J. (2019). Optimizing genome editing strategy by primer-extension-mediated sequencing. Cell discovery 5, 1-11.

4. Liu, Y., Ai, C., Gan, T., Wu, J., Jiang, Y., Liu, X., Lu, R., Gao, N., Li, Q., and Ji, X. (2021). Transcription shapes DNA replication initiation to preserve genome integrity. Genome biology 22, 1-27.