線粒體作為細胞的"能量中心"在細胞生命活動過程中扮演着重要角色，它還是細胞核外存儲遺傳信息的另一細胞器。據MITOMAP數據庫統計，在已确認的97種線粒體遺傳疾病中，93種由點突變引起，因此使用堿基編輯工具修正這些突變具有重要意義。然而線粒體中的電子傳遞将質子從線粒體基質排出，使得基質帶有強負電荷，這阻礙了具有相同負電荷核酸（如CRISPR系統的sgRNA）的進入 ¹。全蛋白基礎的基因編輯工具ZFN和TALEN可以在定位信号的引導下進入線粒體，之前有研究報道在小鼠線粒體中可以據此靶向敲低突變的基因組^2,3。然而，敲低線粒體基因組不能治療純合的線粒體突變，也不能主動改變線粒體基因組的堿基構成。

基于CRISPR-Cas系統開發的單堿基編輯在治療基因組點突變引起的遺傳疾病方面顯示出巨大潛力。堿基編輯器中使用的脫氨酶都是單鍊DNA脫氨酶，在Cas9和sgRNA的作用下，目标DNA雙鍊中的非靶向鍊暴露出來，為單鍊DNA脫氨酶實現有效堿基轉換提供了必要條件⁴。與CRISPR-Cas系統相比，鋅指蛋白（ZF）和轉錄激活因子樣效應子（TALE）隻具有結合DNA雙鍊的活性，卻無法解開DNA雙鍊⁵。因此，簡單将單鍊DNA脫氨酶與ZF或TALE結合無法實現對DNA的有效堿基編輯⁶。

2020年，Joseph Mougous實驗室和David Liu實驗室利用一種能夠作用于雙鍊DNA的脫氨酶DddA開發出了線粒體單堿基編輯器，首次實現了線粒體基因C->T的堿基編輯⁷。2022年Jin-Soo Kim實驗室使用DddA和TadA8e組合，進一步實現了線粒體基因組A->G的堿基編輯⁸。然而，左二偉實驗室和伊成器實驗室随後發現DddA系統存在比較嚴重的脫靶效應^9,10，特别是DddA與CTCF存在相互作用，會産生細胞核基因組的非特異性編輯¹⁰。

2023年5月22日，北京大學魏文勝課題組在Nature Biotechnology雜志在線發表題為 “Strand-selective base editing of human mitochondrial DNA using mitoBEs” 的研究論文，報道了一種名為mitoBEs的全新線粒體單堿基編輯工具，該工具不依賴于DddA系統。mitoBEs不僅能夠高效地實現A->G或C->T的單堿基編輯，還具備選擇性地編輯特定鍊的能力，這是DddA系統所不具備的。此外，研究人員未觀察到明顯的脫靶現象。

由于目前發現的除DddA之外的DNA脫氨酶，都隻能作用于單鍊DNA，整個研究基于這樣的假設：在靶向位點産生瞬時的單鍊DNA，可以為所有“普通” 脫氨酶提供有效反應底物。因此，在TALE系統提供靶向的基礎上，研究者整合了切口酶（nickase）和脫氨酶（deaminase），成功建立了高效的TALE版本的單堿基編輯器，實現了線粒體基因組的堿基編輯（mitochondrial DNA base editors, mitoBEs）。使用含有線粒體定位信号的TALE-MutH和TALE-TadA8e(V106W)靶向線粒體基因組，可以實現有效的A->G編輯（圖1）。對切口酶MutH的突變研究，可以大幅度突破其序列偏好，将可編輯範圍提高10倍以上。此外，無識别序列偏好的切口酶Nt.BspD6I（C）和FokI-FokI(D450A)，也能夠有效應用于mitoBEs系統（圖2）。

圖1: 引入nickase來實現鍊選擇性DNA編輯及mitoBE工作模型

圖2: 篩選可以用于mitoBE系統的無識别序列限制的nickase

除了A->G方向的編輯，TALE-MutH和TALE-rAPOBEC1-2×UGI的結合可以實現C->T的高效堿基轉換。與DdCBE相比，mitoBEs具有鍊選擇性偏好。此外，通過全基因組測序，mitoBEs在線粒體和細胞核中都沒有檢測到嚴重的脫靶編輯，證明其具有高度特異性和安全性。

研究者進一步嘗試這一新型編輯器在疾病治療中的應用。Leber遺傳性視神經病變 (Leber's hereditary optic neuropathy, LHON) 是一種由線粒體基因突變引起的急性眼部疾病，患者均為成年人。研究者利用環狀RNA編碼的mitoBEs實現了高效線粒體DNA鍊選擇性堿基編輯，成功建立了疾病模型。随後，針對LHON患者來源的細胞，使用環狀RNA編碼的mitoBEs在目标位點實現了約20%的編輯效率，修複後的細胞具有更高的ATP含量和氧化呼吸水平，表明mitoBEs對線粒體遺傳疾病具有治療潛力。這是首次通過堿基編輯方式修正了線粒體的緻病突變（圖3）。由于理論上這一新技術能夠修正大多數線粒體疾病突變（圖3），這就為治療這些危害重大的疾病提供了有希望的治療方法。此外，該技術方案也适用于細胞核基因組的堿基編輯，對相關疾病治療提供了潛力巨大的新工具。

圖3: 使用mitoBE糾正LHON病人來源細胞的線粒體基因突變

北京大學魏文勝課題組博士後伊宗裔、博士研究生張小雪為論文的共同第一作者，唐玮、于瑩、魏曉旭和張雪對文章也作出了重要貢獻。該研究項目得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金重點項目、北京市科委生物醫學前沿創新推進項目、北大-清華生命科學聯合中心、昌平實驗室和中國博士後科學基金的支持。

文章鍊接: https://doi.org/10.1038/s41587-023-01791-y

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