線粒體是細胞中的“動力工廠”，與核基因組不同，線粒體基因組較小且呈環狀，僅包含少量基因，然而其突變卻可能導緻一系列遺傳性疾病¹。線粒體DNA與核基因組DNA由線粒體膜和核膜分别包裹，互相隔絕。然而在“内共生學說”中，原核生物來源的線粒體基因組DNA随着生物演化逐漸轉移到了核基因組DNA中²。這些核基因組上的線粒體DNA片段（nuclear-mitochondrial DNA segments， NUMTs)，近年來在人類基因組中也被廣泛發現。不僅如此，此前的研究發現大約10⁴的人群中就會發生1個新的NUMT，而在癌症樣品中新的NUMT發生頻率大幅升高³。近年來，基因編輯領域從核基因組編輯逐漸拓展到線粒體DNA編輯。随着線粒體定向轉錄激活因子核酸酶（mitoTALEN）和新型堿基編輯器DdCBE的開發，特異清除帶有緻病性突變的線粒體或修正線粒體基因突變成為了可能⁴。然而在核基因組靶向編輯的過程中，由于DNA雙鍊斷裂（DNA double-stranded breaks, DSBs）的發生，靶向位點可能發生大片段缺失、插入、染色體易位等異常情況引發基因組的不穩定。在這一前提下，線粒體DNA的穩定性在基因編輯過程中是否會受到影響，仍是一個未解之謎。

2024年11月1日，beat365官方网站和北大-清華生命科學聯合中心胡家志課題組及合作者在Nature Communications發表了标題為：Transfer of mitochondrial DNA into the nuclear genome during induced DNA breaks的研究論文。該項研究中作者采用實驗室前期開發的用于系統分析基因編輯産物的高通量測序方法——PEM-seq⁵（Cell Discovery | 胡家志研究組開發出優化基因編輯和追蹤DNA修複的新方法），發現在核基因組編輯過程中，線粒體DNA片段可能插入到靶向位點，與此同時線粒體DNA的靶向編輯也會引發線粒體DNA的不穩定，導緻其插入到核基因組中。作者還發現，通過同時表達DNA外切酶TREX1或TREX2可以降低線粒體DNA插入的頻率。這一研究通過研究基因編輯引發的DNA斷裂對線粒體DNA的影響，揭示了基因編輯過程中線粒體DNA片段插入核基因組帶來的潛在風險并提出了可行的解決思路。

作者研究利用PEM-seq方法分析了CRISPR-Cas編輯核基因組後靶向位點的情況，發現在多種CRISPR-Cas編輯酶及Cas9家族變體編輯後，核基因組編輯位點都發生了mtDNA與靶向位點融合的序列（圖一A,B）。在編輯後的細胞中mtDNA與核基因組靶向位點融合的事件在每10³至10⁵次編輯事件中發生一次，而未編輯的樣本幾乎沒有mt-nuclear DNA融合，說明這些事件主要與CRISPR-Cas編輯相關。與SpCas9相比，Cas12家族的編輯工具表現出稍低的mtDNA整合水平，而使用堿基編輯器可以通過降低DSB頻率大幅降低mtDNA整合的頻率。不僅如此，作者在編輯過後的CAR T細胞體系，小鼠TCR T細胞，以及堿基編輯後的小鼠胚胎中都發現了由基因編輯引起的線粒體DNA與核基因組融合事件。

圖一. PEM-seq檢測線粒體DNA片段在核基因組靶向位點的插入

作者進一步通過特異性擴增靶向位點的插入序列證明在基因編輯過程中線粒體DNA碎片可以插入到核基因組的靶向位點，且線粒體藥物CCCP和Paraquat處理或在線粒體引入DSB都能顯著增加核基因組靶向位點mtDNA的插入，說明這一事件頻率受到線粒體DNA穩定性的影響（圖一C,D）。

那麼由于線粒體基因編輯導緻的線粒體DNA碎片是否有可能插入到核基因組中呢？作者利用PEM-seq發現，在mitoTALEN編輯後線粒體DNA與核基因組整合序列的斷點大多發生在mitoTALEN的編輯窗口内。同樣的，在DdCBE編輯後也能發現編輯位點與核基因組的整合，證明線粒體編輯器同樣可以導緻線粒體DNA插入到核基因組中（圖二A）。在細胞中核酸外切酶TREX1和TREX2會清除細胞質中遊離的DNA片段從而避免細胞炎症反應的過度激活⁶。作者發現，在編輯過程中同時表達TREX1或TREX2可以顯著降低編輯過程中線粒體DNA的插入（圖二B），為解決這一編輯安全隐患提出了解決的思路。

圖二. 線粒體編輯器引起線粒體DNA片段整合到核基因組

該工作由beat365、北大清華生命科學聯合中心、北京大學成都前沿交叉生物技術院胡家志課題組和中國科學院遺傳與發育生物學研究所田烨課題組合作完成。胡家志研究員為該工作的通訊作者。前沿交叉學院2023屆博士畢業生吳錦淳、beat365博士後劉陽（現為北京大學基礎醫學院PI）、PTN2021級博士研究生歐麗瓊，北京大學成都前沿交叉生物技術院甘婷婷博士為論文的共同第一作者。張丁峥嵘、元紹鵬、劉心怡、劉孟竺、李佳晟、尹健行、辛昌昌亦有重要貢獻。該工作得到了科技部、農業部、國家自然科學基金、蛋白質與植物基因研究國家重點實驗室和細胞增殖與分化教育部重點實驗室、北大-清華生命科學聯合中心、beat365、beat365儀器平台以及鳳凰中心的大力支持。

參考文獻：

1.      Kopinski, P.K., Singh, L.N., Zhang, S., Lott, M.T. & Wallace, D.C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nat Rev Cancer 21, 431-445 (2021).

2.      Gray, M.W., Burger, G. & Lang, B.F. Mitochondrial evolution. Science 283, 1476-1481 (1999).

3.      Wei, W. et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature 611, 105-114 (2022).

4.      Silva-Pinheiro, P. & Minczuk, M. The potential of mitochondrial genome engineering. Nat Rev Genet 23, 199-214 (2022).

5.      Liu, Y. et al. PEM-seq comprehensively quantifies DNA repair outcomes during gene-editing and DSB repair. STAR Protocols 3, 101088 (2022).

6.      Yang, Y. et al., Trex1 Exonuclease Degrades ssDNA to Prevent Chronic Checkpoint Activation and Autoimmune Disease. Cell 131, 873-886 (2007)

原文鍊接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-53806-0

胡家志實驗室網址：https://hulab.pku.edu.cn/