免疫治療已徹底改變了癌症治療的前景并治愈了一部分難以治療的癌症。然而，大多低免疫原性腫瘤仍對現有免疫療法響應率極低。揭示腫瘤免疫逃逸機制有助于高效識别免疫治療新靶點，擴大可治療腫瘤的範圍。早期腫瘤形成中，腫瘤會編輯其基因表達以逃避免疫監視，該‘腫瘤編輯’過程是塑造腫瘤免疫原性的關鍵時期ADDIN EN.CITEADDIN EN.CITE.DATA1-3。新生腫瘤中優先沉默的基因很可能對提升腫瘤免疫原性及誘發有效的抗腫瘤免疫反應起重要作用。探究早期腫瘤編輯優先下調的基因及其表達調控機制将為找到更具抗癌潛力的免疫治療靶點提供重要指南。然而, 腫瘤在被臨床檢測到前已經曆了廣泛的編輯,  捕獲腫瘤編輯早期事件在技術上頗具挑戰性。常用的同源移植腫瘤模型中,  腫瘤細胞系已在體内被充分編輯過,  很難用于早期腫瘤編輯相關研究。由于檢測及分離早期腫瘤的難度, 新發腫瘤中的基因編輯程序及其作用機制尚不明确。腫瘤編輯的前期研究中，關注點通常局限于活化适應性免疫所需關鍵基因，如抗原呈遞與加工相關基因等的表達調控ADDIN EN.CITEADDIN EN.CITE.DATA4。其他可能在腫瘤發生初期調控其免疫原性的重要途徑, 特别是先天免疫途徑的活性變化仍然未知。直到最近,  尚未有研究在全基因組範圍内分析早期腫瘤編輯過程,  并以單細胞分辨率解析該過程中腫瘤細胞及腫瘤浸潤淋巴細胞 (Tumor-infiltrating lymphocytes, TIL) 内的基因表達動态變化。

2024年8月21日，beat365官方网站、北大-清華生命科學聯合中心張瑩課題組與哈佛大學醫學院合作在Nature Immunology 期刊在線發表了題為“Tumor editing suppresses innate and adaptive anti-tumor immunity and is reversed by inhibiting DNA methylation”的研究論文。張瑩研究員與Judy Lieberman教授針對該研究的讨論“Emerging tumor repression of immune recognition is reversed by inhibiting DNA methylation”同期發表于Nature Immunology Research Briefing。該研究利用可誘導乳腺癌的轉基因小鼠模型收集極早期及晚期腫瘤進行全面的單細胞轉錄組測序(scRNA-seq), 揭示了早期腫瘤編輯對腫瘤中關鍵先天及适應性免疫通路的優先沉默，對TIL分化、功能及腫瘤-免疫細胞通信的顯著影響，并闡釋了DNA去甲基化治療在逆轉腫瘤免疫編輯、促進炎性癌細胞死亡、提升腫瘤免疫原性及抗腫瘤免疫力方面發揮的重要功效。轉基因小鼠腫瘤模型中, 誘導特定組織内緻癌基因的表達可在原位引發腫瘤,  腫瘤細胞可特異性表達熒光蛋白以便于早期腫瘤的捕獲。相較于依賴細胞系的移植腫瘤，轉基因小鼠腫瘤更接近人類癌症, 通常對免疫治療不敏感，是研究早期腫瘤編輯、腫瘤微環境中腫瘤-免疫互作演變及潛在免疫治療策略的理想嚴格模型。本研究中, 作者利用了一種可誘導乳腺癌的轉基因小鼠模型 ‘ErbB2DEx16小鼠’,  其可在多西環素(Dox)誘導後在乳腺上皮細胞中特異表達緻癌基因Her2的持續激活突變體ErbB2DEx16,  在7-28天内引發侵襲性乳腺癌。乳腺腫瘤的淺表位置使研究者可第一時間探測腫瘤發生并取樣。Dox誘導僅一周左右, 研究者即可收集新發早期腫瘤, 并收集誘導一個月左右的晚期腫瘤同時進行scRNA-seq,  分析腫瘤早期發生過程中腫瘤細胞和TIL内全基因組水平的基因表達變化(圖1.A)。結果顯示，晚期腫瘤相較于早期腫瘤主要下調先天及适應性免疫途徑相關基因的表達(圖1.B)，而與腫瘤細胞自身存活、增殖及侵襲相關基因的表達變化不大,  提示早期腫瘤編輯主要為免疫編輯。下調基因主要富集在先天免疫途徑,  包括I型及II型幹擾素 (Interferon,  IFN) 信号傳導,  病毒防禦反應,  及細胞因子信号通路。晚期腫瘤細胞中下調基因所富集的前20條最顯著通路全部為先天免疫途徑,  提示其對腫瘤免疫原性有重要影響。腫瘤進展中，早期腫瘤中初始及效應CD8+TIL大部分被功能耗竭或耗竭前體CD8+TIL所取代。同時,  腫瘤細胞與NK或不同CD8+TIL亞群之間的多種重要通訊，包括IFN-g及IL-2通路，CD80和LIGHT共刺激信号等抗腫瘤免疫途徑均被破壞(圖2)，突顯了早期腫瘤編輯削弱腫瘤免疫原性的能力。

圖1.早期腫瘤編輯優先下調免疫相關基因表達。A，為探究早期腫瘤進展中的基因編輯及腫瘤-免疫細胞間的通信動态變化，研究人員在Erbb2ΔEx16 轉基因小鼠中誘導侵襲性乳腺癌，并在誘導約一周或一個月後收集早期或晚期腫瘤樣品，通過單細胞轉錄組測序進行比較分析。  B，晚期腫瘤中下調的229個基因顯著富集的179個Gene Ontology (GO)通路的互作網絡，網絡由GO通路的相似性及其共享基因決定。節點大小與富集通路的顯著性正相關。結果顯示早期腫瘤編輯中，先天免疫、适應性免疫及線粒體代謝途徑相關基因表達被優先抑制。

圖2.腫瘤早期進展中腫瘤-免疫細胞間的細胞通訊受到破壞。A，早期和晚期腫瘤中的細胞間通訊變化最顯著的前30條互作通路(CellChat分析)。多條免疫相關互作通路在晚期腫瘤中完全消失。B，早期腫瘤中三條活躍的腫瘤-免疫細胞通訊途徑，包括II型幹擾素及共刺激因子信号通路在晚期腫瘤中完全消失。圖中線的顔色與細胞通訊中表達配體的細胞節點顔色一緻，線條指向表達受體的不同細胞亞群。線的寬度代表通訊信号的強度。

表觀遺傳修飾是調控腫瘤中基因表達的重要機制，其中DNA甲基化可抑制多種免疫基因表達ADDIN EN.CITEADDIN EN.CITE.DATA5。為探究早期腫瘤編輯的作用機制，研究者利用攜帶乳腺癌或黑色素瘤的多種自發或同源移植腫瘤小鼠模型，使用低劑量DNA甲基轉移酶抑制劑地西他濱(Decitabine, DAC) 治療。結果顯示DAC可強效抑制腫瘤生長甚至治愈以形成的轉基因小鼠腫瘤, 同時高效提升抗腫瘤免疫力，增加腫瘤微環境中殺傷淋巴細胞的數量及功能，增加具有更強腫瘤殺傷能力的組織駐留記憶CD8+TILADDIN EN.CITEADDIN EN.CITE.DATA6及負責抗原交叉呈遞激活CD8+T細胞的經典I型樹突細胞ADDIN EN.CITEADDIN EN.CITE.DATA7的數量，同時大幅降低髓系抑制性細胞的數量。進一步研究發現, 在攜帶ErbB2DEx16或4T1原位乳腺癌，或B16F10黑色素瘤的荷瘤鼠中使用低劑量DAC治療可顯著提升多種先天免疫基因表達，包括參與炎性細胞死亡、炎性細胞因子及I型幹擾素(IFN-I)信号通路的不同關鍵基因。同時，研究人員對低劑量DAC處理的乳腺癌細胞系進行轉錄組測序，發現DAC主要上調基因表達。令人意想不到的是，DAC上調基因幾乎完全富集于能夠提升腫瘤免疫原性的免疫相關通路(圖3)。DAC最顯著上調的基因主要富集在IFN 信号轉導、 炎症細胞因子及T細胞免疫相關重要途徑、以及炎性細胞死亡途徑(包括細胞焦亡和壞死性凋亡)。重要的是，分析發現DAC在乳腺癌細胞中上調的基因與轉基因小鼠腫瘤從早期向晚期發展過程中下調的基因顯著重疊(圖3.A)。重疊基因大多是幹擾素誘導基因(Interferon stimulated genes, ISG),  參與所有主要的先天及适應性免疫通路。重疊基因最顯著富集的前 22 個GO 為先天免疫途徑, 表明優先沉默關鍵先天免疫途徑是免疫編輯降低腫瘤免疫原性的主要方式,  而DNA甲基化是早期腫瘤免疫編輯的重要機制之一。

圖3. DNA甲基化在腫瘤編輯及腫瘤免疫原性調控過程中的重要作用。A，為探究DNA甲基化對早期腫瘤基因表達調控及腫瘤免疫原性的影響，研究人員使用PBS或地西他濱(DAC)處理小鼠乳腺癌4T1細胞系48小時後進行轉錄組測序。本研究同時将Erbb2ΔEx16 轉基因小鼠晚期腫瘤相對于早期腫瘤顯著下調基因與DAC處理4T1系後顯著上調基因進行重疊分析。上：韋恩圖顯示兩數據集中非重合(藍色，紅色)及重合部分基因數；下：表格顯示84個顯著重疊基因，其中紫色高亮基因為幹擾素刺激基因(Interferon Stimulated Genes，ISGs)，證明早期腫瘤編輯中DNA甲基化是抑制免疫基因表達的一種關鍵機制。B，DAC處理4T1細胞後顯著上調基因所富集的前150個最顯著GO通路的互作網絡，結果顯示DNA去甲基化治療優先上調先天及适應性免疫相關基因，提升腫瘤免疫原性。

本研究同時發現, DAC治療能在腫瘤内高效激活炎性癌細胞死亡, 包括膜打孔蛋白GSDME介導的細胞焦亡以及RIPK3介導的壞死性凋亡。盡管DAC處理腫瘤細胞中IFN-I信号通路相關基因上調最為顯著, 利用DAC 治療IFN-I受體Ifnr敲除的小鼠并未顯著影響其抗腫瘤能力。敲除腫瘤細胞中的Gsdme、Ripk3、或IFN-I通路關鍵轉錄因子Irf3/7均可顯著削弱DAC抑制腫瘤生長及激活抗腫瘤免疫力的能力, 表明多種先天免疫通路(幹擾素、焦亡和壞死性凋亡)的激活都可作為危險信号招募并激活殺傷淋巴細胞，誘導有效的抗腫瘤免疫反應并增強免疫系統對腫瘤的控制。

綜上，該研究詳細刻畫了早期乳腺癌中的腫瘤編輯進程，揭示了腫瘤編輯對關鍵先天免疫途徑的優先抑制及其在調控腫瘤免疫原性中的重要性，闡釋了DNA甲基化在腫瘤免疫編輯中發揮的關鍵作用并證明了通過DAC抑制DNA甲基化的抗癌潛能及作用機理。該研究提示，通過靶向性地表觀遺傳調控提升腫瘤中關鍵先天免疫途徑的活性有潛力促進腫瘤由“冷”轉“熱”，為提升抗腫瘤免疫力及開發高效免疫治療新策略提供了新思路。

beat365官方网站張瑩研究員與哈佛大學醫學院博士後Pourya Naderi Yeganeh為本文第一作者。beat365官方网站張瑩研究員、哈佛大學醫學院Winston Hide教授及Judy Lieberman教授為本文通訊作者。本研究得到北大-清華生命科學聯合中心，beat365官方网站及細胞增殖與分化教育部重點實驗室的大力支持和資助。

原文鍊接：https://www.nature.com/articles/s41590-024-01932-8

參考文獻

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