在早期胚胎發育過程中，胚胎着床是一個極為關鍵的生物學事件。期間胚胎植入母體子宮，建立母胎交流界面，這是後續發育的基礎。然而這一過程充滿風險，臨床上常常出現因着床失敗導緻的生育問題。由于該過程極為瞬時和動态，胚胎着床方面的研究仍是一個“黑匣子”。

miRNA是真核生物中保守的轉錄後調控機制，并在着床過程中起到重要作用。DGCR8是miRNA合成通路的核心蛋白，它與DROSHA一起組成Microprocessor複合體，切割pri-miRNA上的莖環結構形成pre-miRNA, pre-miRNA再進一步被加工為成熟的miRNA。¹ DCGR8敲除後，胚胎無法發育至着床後階段，暗示着DGCR8在着床過程中起到重要作用，然而該緻死表型卻不能完全用miRNA的缺陷來解釋。 ^2,3

與尚不清楚的着床期過程相比，人們對于着床前胚胎和着床後的胚胎已有廣泛的研究，這主要得益于體外幹細胞模型的建立。由着床前胚胎分離得到的幹細胞被稱為naïve mESCs（小鼠胚胎幹細胞），而着床後胚胎分離得到的幹細胞被稱為Formative/Primed mESCs，這幾種細胞已被廣泛應用于各種發育問題的研究。 ^4,5 杜鵬課題組在2018年捕捉到了一種介于naive和Formative/primed多能性的中間态多能性幹細胞，稱為Poised mESCs。 ^6,7 該狀态代表了處于着床期的胚胎,且由一組特異的miRNA所調控。

2024年7月1日，北京大學杜鵬課題組在Molecular cell雜志在線發表了題為：A transient transcriptional activation governs unpolarized-to-polarized morphogenesis during embryo implantation的研究論文。在本研究中，研究者運用naïve-poised-formative/Primed等幹細胞模型，結合實驗室先前在miRNA調控方面的研究基礎，解釋了驅動着床期胚胎形狀建成的分子驅動力，主要内容概括如下：

1.DGCR8作為miRNA合成通路的核心蛋白，可以發揮不依賴于miRNA的轉錄抑制的非經典功能。在naïve mESCs中（代表着床前胚胎），DGCR8可以結合位于mRNA上短的莖環結構，招募并隔離轉錄激活子FLII，抑制轉錄進行。 在Poised mESCs中（代表着床中胚胎），ERK通路瞬時激活，使得FLII受到磷酸化修飾并與DGCR8解離，進而與轉錄因子JUN結合并激活細胞遷移基因的轉錄。着床後ERK通路迅速失活（Formative mESCs），DGCR8重新結合并抑制FLII。因此DGCR8/FLII/JUN在ERK通路的介導下，在着床期特異地介導了一個瞬時轉錄激活事件的發生（圖1）。

2.該轉錄激活事件控制了胚胎着床期由無序狀态到極化狀态的形态轉變。且該事件在人和小鼠是保守的（圖1）

圖1: 在着床前(naive)-着床中(Poised)-着床後(Formative)發育過程中，DGCR8/FLII/JUN在ERK通路調控下介導瞬時轉錄激活事件的發生，進而調控着床期胚胎形态轉變。

本研究具體結論如下：

一：在naïve mESCs中， DGCR8通過結合mRNA上的莖環結構，招募并抑制轉錄激活子FLII。

基于前期的naïve小鼠胚胎幹細胞中DGCR8互作蛋白數據/Co-IP/Pull down，作者發現，DGCR8與轉錄激活子FLII存在直接的蛋白相互作用。然而FLII并不參與miRNA合成通路。通過比較多種細胞系的轉錄組，作者發現傳統的miRNA調控基因在敲除Dgcr8和Dicer這兩個對于miRNA合成必需的基因後，由于miRNA整體缺失，都會出現整體上調的情況(圖2）。另一大類基因隻在Dgcr8敲除後上調，在Dicer敲除後則沒有表型,這證明這部分基因不受miRNA的調控。在Dgcr8敲除的基礎上敲除Flii (DF-dKO mESCs)，這部分基因的上調被消除(圖2）。綜合其他結果說明：DGCR8和FLII共同在轉錄水平上控制了一組不受miRNA調控的基因，該類基因主要參與細胞遷移等活動，稱為非miRNA靶向基因。DGCR8和FLII對于這類基因起到相反的調控作用，DGCR8抑制，而FLII則激活這類基因的表達。

圖2:DGCR8/FLII控制的非miRNA靶向基因的鑒定。

為了進一步研究DGCR8如何抑制這類基因的轉錄，在naïve小鼠胚胎幹細胞中，作者通過eCLIP實驗鑒定了DGCR8/FLII的RNA結合靶點，同時在eCLIP實驗中還摻入了S⁴U，可以同時鑒定出新生的RNA （nascent RNA）。作者發現DGCR8和FLII同時結合了大量的靶基因的新生mRNA，且DGCR8結合區域傾向于形成莖環結構(圖3.A-B)。該莖環結構顯著短于pri-miRNA上的莖環結構，并不能被DGCR8和DROSHA形成的複合體結合并切割。通過敲除DGCR8所結合的位于靶基因mRNA上的莖環結構，靶基因的轉錄抑制狀态被解除 (圖3.C)。這證明DGCR8确實通過結合mRNA上的莖環結構來抑制轉錄。

綜上，這說明DGCR8一方面和DROSHA結合負責pri-miRNA的切割，一方面結合在靶基因mRNA上的莖環結構，招募并抑制轉錄激活子FLII，從而抑制轉錄的進行。

圖3: A:DGCR8與FLII共同結合靶基因的mRNA，但FLII并不結合miRNA。B:DGCR8/FLII結合在靶基因mRNA上的莖環結構。C:敲除對應基因的莖環結構，其轉錄抑制得到解除。

二：FLII在naïve-poised-formative多能性轉變過程中促進一組細胞遷移相關基因的激活及Poised多能性的建立。

在naïve-poised-formative（着床前→着床中→着床後）轉變體系中，作者發現：與正常細胞相比，缺失FLII的細胞在該過程中逐漸死亡，說明FLII對于該過程是必需的(圖4.A-B)。 轉錄組分析發現：FLII的缺失并不影響細胞退出naïve多能性，而是特異的影響了Poised時期特異的細胞遷移相關基因的激活。進一步的，細胞也無法正常繼續發育到formative多能性(圖4.C-D)。綜上結果說明：盡管FLII在naïve時期沒有轉錄激活活性，但它在Poised時期重新獲得了轉錄激活活性，并激活了一組細胞遷移相關基因的表達，促進Poised多能性的建立。這一過程對于随後轉變到Formative多能性也是必需的。

圖4: A:用EB和EpiLC分化兩個分化體系來實現naïve-poised-formative多能性轉變。 B:FLII缺失的細胞在EB分化過程中逐漸死亡。C,D:轉錄組分析顯示:FLII特異的激活Poised多能性特異基因。FLII缺失會導緻Poised多能性建立失敗，随後無法發育至Formative多能性。

三：FLII在Poised mESCs(代表着床期胚胎)中與DGCR8解離，并與轉錄因子JUN結合，激活Poised特異的細胞遷移基因。

特異地，FLII在Poised時期解除了與DGCR8的互作，同時也不再結合靶基因的mRNA (圖5.A-B)。這說明FLII與DGCR8的解離是FLII具有轉錄激活活性的關鍵條件。通過一系列生化實驗，作者證明naïve-poised轉變過程中，ERK通路瞬時激活，磷酸化FLII，使得FLII與DGCR8不再結合。 同時磷酸化的FLII會與轉錄因子JUN互作增強。通過抑制MEK/ERK通路，DGCR8/FLII的解離得到阻止，而FLII/JUN的形成則被抑制(圖5.C)。

圖5: A:DGCR8與FLII在Poised mESCs中解除互作。B:FLII的RNA結合信号在poised mESCs中消失。C:在Poised時期抑制MEK/ERK通路阻止DGCR8/FLII的解離，抑制FLII/JUN複合體的形成。

為了進一步探究JUN是否和FLII一起促進了Poised多能性的建立，作者構建了Jun敲除與過表達的細胞系以探究JUN在多能性轉變中的作用。結果發現: 與Flii類似，Jun的敲除同樣影響了細胞遷移基因的激活，導緻Poised多能性無法建立，并進一步影響到了formative多能性的建立。相反的是, Jun 過表達顯著增強細胞遷移基因的表達，并延長了其表達時間，最終導緻Poised多能性的持續時間延長，阻止了進一步發育至formative多能性(圖6.A-B)。

圖6: A:缺失Jun的細胞無法激活細胞遷移基因及Poised多能性。B:JUN的過表達導緻細胞遷移基因的過度激活且激活時間延長，使得Poised多能性持續的時間延長。

四：FLII促進JUN對DNA的結合，進而激活細胞遷移基因并建立Poised多能性。

作者進一步探究了FLII在JUN激活基因表達中的作用，作者在多種細胞系中進行了CUT&Tag實驗，結果發現: JUN廣泛的結合在Poised時期激活的細胞遷移基因的啟動子/增強子上，且Flii缺失後，JUN幾乎完全喪失了DNA結合能力，此外，FLII過表達可以顯著增強JUN的結合能力。以上結果說明FLII通過促進JUN對DNA的結合來實現轉錄激活作用 (圖7)。

圖7: FLII促進JUN對于Poised時期特異激活的細胞遷移基因的結合。

五：Poised 多能性幹細胞代表小鼠和人的着床期胚胎的上胚層細胞，這一時期的胚胎正經曆無序到極化的形态轉變。

通過與體内胚胎的轉錄組比較，作者發現Poised ESCs的轉錄組與小鼠和人的着床期胚胎轉錄組最為相似（小鼠為E4.75天，人為E8天）。這一時期胚胎的上胚層細胞逐漸從無序狀态變成玫瑰花環樣的極化結構。且在體外培養的着床期小鼠胚胎中，能夠觀察到JUN和其他靜息态多能性标記基因的表達，進一步證明了已有結論(圖8)。通過體外模拟無序到極化的形态轉變體系，作者發現抑制該轉錄激活事件都會導緻無序到極化結構形态轉變的失敗。因此，本文中鑒定到的轉錄激活事件對應于着床期胚胎，而激活基因以細胞遷移相關基因為主，則對應着這一時期細胞的形态轉變。

圖8：Poised mESCs的标記蛋白定位于着床期胚胎的極化中心（PLAUR/FGFBP1）或者上胚層細胞（JUN）中。

綜上，該研究發現了DGCR8獨立于miRNA之外的轉錄抑制功能，并與FLII/JUN一起，在ERK通路的控制下，控制了着床期的瞬時轉錄激活事件，進而控制這一時期的形态建成。

beat365官方网站/北大-清華生命科學聯合中心/北京大學核糖核酸北京研究中心的杜鵬教授為該論文的通訊作者。beat365官方网站博士後呂學晖，崔英姿，前沿交叉學科研究院博士後孔寅飛為本文的并列第一作者。北京大學畢業博士生楊敏，博士後申輝，博士後李詩雨，已出站博士後翁建莉，北京大學張哲研究員及其博士生廖述筠，中科院動物所王皓毅研究員其已畢業博士生安辰瑞，山東大學李豔研究員對本文有重要貢獻。該項工作得到了國家重點研發計劃，國家自然科學基金的支持。

原文鍊接：https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(24)00483-0

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