2024年5月29日，beat365官方网站Jackson Champer課題組在Nature Communications上發表題為Germline Cas9 promoters with improved performance for homing gene drive的研究論文。本研究旨在尋找和測試具有優秀驅動性能的Cas9啟動子，以助力高效基因驅動系統的構建。 Champer課題組構建并測試了11個不同的生殖系Cas9啟動子的基因驅動性能。結果表明，一些啟動子（如rcd-1r和CG4415）可提高驅動轉換率并降低胚胎抗性等位基因形成率。此外， Champer課題組選擇了三個Cas9啟動子品系，結合複合表達4個gRNA的抑制驅動品系，進行了多世代的籠子實驗。實驗結果顯示，CG4415啟動子的驅動性能明顯優于nanos啟動子，成功消滅了籠子種群。綜上所述，這些Cas9啟動子在構建高效的果蠅歸巢基因驅動系統中展現出了極大的優勢，同時也為其他物種的相關研究提供了重要參照。

基因驅動（Gene Drive）技術能夠使特定的基因型偏向性地遺傳給後代，因而在控制害蟲種群和減少媒介傳播疾病方面具有巨大的應用潛力，是近年來新興的研究熱點。基因驅動可分為種群修飾型驅動（population modification drive）和種群抑制型驅動（population suppression drive）。種群修飾型驅動通過攜帶載荷基因，使種群内個體獲得相應的表達性狀，而種群抑制型驅動則可為了健康、生态或經濟目的減少或消滅目标害蟲種群。

CRISPR歸巢基因驅動是目前研究最廣泛的，也可能是最強大的基因驅動系統。在含有驅動等位基因的雜合子中，驅動等位基因在生殖系細胞減數分裂早期表達Cas9和gRNA，靶向切割野生型等位基因，形成雙鍊斷裂後，野生型等位基因通過同源重組修複轉化為驅動等位基因，這個過程稱為“驅動轉換（drive conversion）”或“歸巢（homing）”。當生殖系細胞從雜合子發生驅動轉換為純合子時，驅動等位基因能夠以更高的比例遺傳給下一代。然而，并不是所有的雙鍊斷裂都會以同源重組的方式修複，若斷裂以末端連接的方式進行修複，靶位點突變後會形成抗性等位基因，阻止gRNA識别。該情況主要發生于胚胎期和體細胞期，由母體沉積的Cas9和洩露表達的Cas9造成。抗性等位基因的存在可能會嚴重阻礙基因驅動在種群中傳播，甚至導緻驅動失敗。Cas9的特異性表達對于基因驅動十分關鍵，一個理想的基因驅動Cas9啟動子應隻在減數分裂早期開啟表達，在胚胎發育和體細胞階段關閉，即可在基因驅動系統中達到高驅動轉換率，低抗性等位基因形成率和低水平的體細胞表達[1, 2]。已有研究表明，果蠅的nanos啟動子能夠避免體細胞洩露表達，但母體沉積的Cas9仍導緻較高的胚胎抗性。

圖1 歸巢基因驅動中的Cas9活性

（A）    驅動轉化發生在驅動/野生型雜合子的生殖系細胞中。（B）根據基因驅動的類型，某些個體可能無法存活或者不育。

本研究中， Champer課題組以前人研究較多的nanos和vasa啟動子為基礎，根據黑腹果蠅早期胚胎的生殖系限定表達和低mRNA水平選擇其他啟動子，構建了兩種類型的驅動系統 。其中，合成驅動系統的Cas9元件和gRNA驅動元件位于同一等位基因中，并靶向EGFP基因[3]。測試結果表明，大多數啟動子在雄性中的驅動遺傳率為72-89%，在雌性中為85-95%，其中隻有rcd-1r, shu和CG4415啟動子展示出明顯較低的胚胎抗性等位基因形成率。由于測試品系中的EGFP隻在果蠅眼部表達，因此該合成驅動系統隻能觀察Cas9/gRNA在眼部的切割活動，無法評估體細胞和胚胎抗性的發生情況。

在分離驅動中，Cas9元件與gRNA驅動元件位于不連鎖的等位基因中，需将兩種品系雜交後測試驅動轉換效率，便于評估啟動子在不同靶标位點和驅動設計中的表現。本研究中， Champer課題組分别選擇了靶向X染色體連鎖的yellow基因的分離驅動元件、靶向單倍緻死基因RpL35A基因2-gRNA驅動元件，靶向雌性生殖關鍵的單倍充足基因yellow-G的4-gRNA分離驅動元件來測試驅動效率。其中，靶向yellow基因的分離驅動，比EGPF驅動有着更低的胚胎抗性，并且可以評估來自雌性的生殖系抗性遺傳。結果顯示，3個有着高驅動遺傳率的Cas9啟動子元件可避免高胚胎抗性，分别是rcd-1r，CG4415和shu啟動子。而在靶向RpL35A基因的分離驅動中，任何無功能的抗性等位基因都會導緻個體不可存活。因此，胚胎抗性是有害的，帶有抗性等位基因的個體将會從種群中快速清除。除了帶有shu啟動子的Cas9元件，其他啟動子均展示了雄性的高驅動遺傳率。相比EGFP合成驅動和靶向yellow的分離驅動，靶向yellow-G基因的歸巢抑制驅動有着更低的胚胎抗性。除了良好的性能參數，它還有強烈抑制的潛力。相比nanos啟動子，已鑒定的啟動子的體細胞表達量沒有明顯降低，但是它們有更低的生殖系表達，可降低适合度代價，其中一些啟動子有更低的胚胎抗性。相關實驗表明隻有CG4415啟動子有着較高的卵成活率。

圖2  靶向yellow基因的驅動性能

在之前的研究中，Champer課題組發現果蠅的nanos啟動子，在單管雜交中展示出較少的适合度代價，但在籠子種群中有着明顯提高的适合度代價，這可能與nanos啟動子的高胚胎抗性有關[4]。本研究中，Champer課題組選擇了三個Cas9品系進行多代籠子實驗，其中一個為rcd-1r啟動子和shu 3’UTR的組合，另外兩個為CG4415啟動子和nanos 3’UTR的組合（其中一個EGFP與Cas9方向一緻，另一個放置于不同的染色體臂中）。在由rcd-1r啟動子表達Cas9的籠子1中，驅動載體頻率緩慢增加，但始終低于27%，僅達到一個較低的平衡值。而由CG4415啟動子表達Cas9的籠子2，驅動載體頻率增加較快，并且籠子種群最終得到抑制。後續實驗分别為大部分使用了較幹燥的食物和僅使用了新鮮的食物，更為幹燥的食物一組（籠子3）僅能達到平衡，新鮮的食物一組（籠子4）可支持了籠子2結論。此外，本研究還使用了位于“site C”位點的CG4415- Cas9元件分别進行了三次籠子試驗（籠子5-7），由于Cas9元件帶有的雌性雜合子适合度代價較低，驅動載體頻率增加并且最終抑制了種群，但是這些籠子的種群規模相對較低。本研究認為，CG4415啟動子在籠子中的适合度代價明顯低于nanos啟動子和rcd-1r啟動子。并且與nanos啟動子相比，CG4415啟動子的胚胎抗性顯著降低，這足以抑制大型、強健的果蠅籠子種群。

圖3 歸巢抑制驅動的多世代籠子實驗

綜上所述，本研究表明，通過組合不同的Cas9的啟動子、5’UTR和3’UTR等調控元件，能夠有效提高歸巢驅動的效率。在不同的驅動系統中，Champer課題組鑒定了不同啟動子的優勢和劣勢，以及它們與不同驅動元件的相互作用。這些調控元件為果蠅的驅動系統提供了較大的優勢，它們的同源物在其他物種中也可作為有用的潛在候選者。

beat365官方网站博士後杜捷為本論文的第一作者， Jackson Champer研究員和杜捷為論文的通訊作者。2022級清華大學PTN項目博士生陳為哲、科研助理賈熙華、博士後徐雪嬌、實習生周睿知、2021級beat365官方网站本科生張雨琪、康奈爾大學本科生Emily Yang和Matt Metzloff，康奈爾大學助理教授Philipp W. Messer等多位成員對本論文有着重要貢獻。該研究得到了北京大學、生命科學聯合中心、國家自然科學基金、beat365官方网站啟東創新基金、美國國立衛生研究院獎等機構和經費的大力支持。

原文鍊接： https://www.nature.com/articles/s41467-024-48874-1

參考文獻：

1.      Champer, J., Buchman, A. & Akbari, O. S. Cheating evolution: engineering gene drives to manipulate the fate of wild populations. Nat. Rev. Genet. 17, 146–159 (2016).

2.     Wang, G.-H. et al. Symbionts and gene drive: two strategies to combat vector-borne disease. Trends Genet. 37, 708–723 (2022).

3.     Champer, J. et al. Molecular safeguarding of CRISPR gene drive experiments. Elife 8, e41439 (2019)

4.     Yang, E. et al. A homing suppression gene drive with multiplexed gRNAs maintains high drive conversion efficiency and avoids functional resistance alleles. G3 Genes|Genomes|Genetics. 12, jkac081 (2022).