DNA複制是生命體最基礎的生物學過程，控制着遺傳信息的精确傳遞。複制源激活形成的一對“Y”形姐妹複制叉（sister replication forks），以相反方向進行複制，直至與另一個相向行進的複制叉相遇，發生複制終止（1）。早期，領域内對DNA複制的理解主要建立在一些簡單模式生物的研究上，核心問題在于理解複制起始、延伸和終止過程以及複制進程的細胞周期調控，并成功利用芽殖酵母的純化蛋白在體外重建了真核生物的DNA複制起始過程，實現了從複制源識别到複制叉形成的整個生化過程（2）。

盡管在模式生物中的研究取得了矚目進展，我們對高等哺乳動物DNA複制的理解仍然隻是冰山一角。DNA複制發生在染色質上，因而會受到染色質環境及其它DNA代謝過程的調控。酵母的DNA含量僅為人細胞的1/500，且僅具有相對簡單、初步的染色質結構（3），而高等哺乳動物的基因組巨大，其染色質高度折疊，在細胞核内部形成龐大的“染色質疆域”，其中每條染色體都具有十分複雜的層級結構（4）。在這樣的情況下，執行DNA複制的分子機器并非孤立存在，而是可能在空間上相互靠近，形成“複制工廠（replication factory）”，有規律地執行複制過程（5）。因此，哺乳動物的DNA複制既會受到染色質環境的調控和約束，又需要有組織地運行，不斷協調與其它DNA代謝事件的關系，在保證DNA和表觀遺傳信息穩定遺傳的同時維護基因組的穩定性（5-7）。随着研究技術的發展和研究數據的積累，在未來，系統性、整體性地研究人類複雜染色質環境下的DNA複制将是一個必然趨勢。哺乳動物複制系統的複雜性給研究帶來了巨大挑戰，也緻使領域内對人類自身DNA複制的獨特機制了解尚不深入。此外，高通量、高分辨率研究方法也缺乏，導緻目前這一領域的發展仍然處于初級階段。

2024年3月15日，beat365官方网站和北大-清華生命科學聯合中心胡家志課題組在Science發表了題為Fork coupling directs DNA replication elongation and termination的研究論文，該研究建立了首個檢測DNA複制叉附近染色質相互作用的方法，并發現在人類和小鼠細胞的DNA複制過程中，複制叉并非傳統模型中認為的獨立反方向前進，而是彼此之間能夠以偶聯的形式持續相互作用，協同完成整個複制延伸過程，并指導複制終止（圖3）。

課題組首先建立了一種名為Repli-HiC的高通量測序方法，該方法利用核苷類似物BrdU瞬時标記複制過程中的細胞，并結合ChIA-PET和原位Hi-C的技術原理檢測複制過程中新生DNA區域相關的染色質相互作用。通過Repli-HiC得到的染色質互作矩陣，研究者在人類K562細胞和小鼠胚胎幹細胞中觀察到垂直于互作矩陣對角線的染色質互作信号，其形狀類似于噴泉結構，故将其命名為染色質噴泉，并利用新開發的生物信息學算法Fun，在基因組範圍内鑒定出了數千個噴泉位點（圖1）。

圖1. Fun算法鑒定到的染色質噴泉位點在基因組上的分布情況。

結合課題組先前開發的基于核苷類似物插入檢測DNA複制起始事件的測序方法NAIL-seq（7）以及用于鑒定DNA複制事件的岡崎片段測序OK-seq（8），該研究進一步發現染色質噴泉的形成可能和DNA複制過程緊密聯系，并根據它們的結構特征和形成模式将其劃分為兩大基本類型：第一類和第二類染色質噴泉。其中，第一類噴泉結構的延伸長度較短（中位數為160kb）、寬度較窄，結構的初始位置和複制起始區域相對應，而延伸的末端與複制終止區共定位。該結構暗示着從同一個起始源發生的一對姐妹複制叉從複制的起始位置開始，便以偶聯的形式持續地相互作用在一起，按照大緻相等的速度進行雙向複制，直至複制終止區域（圖2 A和2B）。同時，這類噴泉結構也暗示着姐妹複制叉雙生子（replication twinsome）結構可能是複制工廠的基礎單元，為複制工廠理論提供了重要的分子證據。第二類噴泉的延伸長度較長（中位數為1Mb左右）、寬度較寬，且噴泉結構的中心坐落于複制終止區域發生的位置，兩側末端則存在DNA複制起始事件。該結構表明來自于兩個不同複制起始區域的複制叉，也在染色質相互作用下有機會成對偶聯，由兩側向中心區域相向行進，直至到達複制終止區域（圖2 C和2D）。這表明DNA複制終止是一個預決定的事件，而非一個随機發生的複制叉碰撞事件（圖3）。

圖2 DNA複制叉偶聯。

A-D.偶聯的姐妹複制叉（A和B）和相向行進複制叉（C和D）分别形成第一類和第二類染色質噴泉結構。在A和C中，EdU/HU鑒定早期複制起始；OK-seq鑒定複制起始（由負到正）和終止（由正到負）。淺綠色背景中展示了Repli-HiC分析複制起始、延伸和終止階段的二維矩陣示意圖。

綜上，該研究是領域内首次在高等哺乳動物細胞中系統解析DNA複制叉在染色質環境下成對偶聯延伸的空間組織模式，不僅支持複制工廠的基本模型，提出了DNA複制終止的預決定模型，颠覆了傳統教科書中的模型（圖3），更為系統性研究DNA複制、基因組穩定性和相關生理疾病的發生提供了全新的視角和理論基礎，同時引申出一系列重要的科學問題：複制叉偶聯的結構基礎、分子機制及背後的生理學意義是什麼，複制叉的偶聯過程如何受到染色質環境及其它DNA代謝事件的調控等。總之，該研究為DNA複制領域鋪平了道路。

圖3. 複制的經典模型和本工作提出的複制叉的偶聯模型。

傳統模型認為相互分離的DNA複制叉執行複制延伸和終止。本工作發現DNA複制叉在整個複制過程中并不是孤立的，而以互相偶聯的形成指導DNA合成。

該工作由beat365官方网站和北大-清華生命科學聯合中心胡家志研究員、李晴教授、孔道春教授、高甯教授和季雄研究員組合作完成，胡家志研究員為該論文的通訊作者。beat365博士後劉陽博士、2021級博士研究生張丁峥嵘及劉栩豪為該論文的共同第一作者。甘婷婷博士、艾晨博士、吳錦淳博士、梁昊昕、陳莫晗、郭嶽峰、盧如森、蔣永鵬博士等在該工作中亦有重要貢獻。該研究還得到了beat365官方网站吳虹教授、中科院生物物理所朱冰研究員和浙江大學生命科學研究院阮一駿教授的幫助和指導。該工作得到了國家自然科學基金、科技部及農業部的支持。

原文鍊接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.adj7606

胡家志實驗室網址：https://hulab.pku.edu.cn/

參考文獻：

1              O'Donnell, M., Langston, L. & Stillman, B. Principles and concepts of DNA replication in bacteria, archaea, and eukarya. Cold Spring Harb Perspect Biol 5, doi:10.1101/cshperspect.a010108 (2013).

2              Gasser, S. Once and Only Once. Cell 177, 495-498, doi:10.1016/j.cell.2019.03.034 (2019).

3              Shao, Y. et al. Creating a functional single-chromosome yeast. Nature 560, 331-335, doi:10.1038/s41586-018-0382-x (2018).

4              Finn, E. H. & Misteli, T. Molecular basis and biological function of variability in spatial genome organization. Science 365, doi:10.1126/science.aaw9498 (2019).

5              Vouzas, A. E. & Gilbert, D. M. Mammalian DNA Replication Timing. Cold Spring Harb Perspect Biol 13, doi:10.1101/cshperspect.a040162 (2021).

6              Wu, J. et al. Cohesin maintains replication timing to suppress DNA damage on cancer genes. Nat Genet 55, 1347-1358, doi:10.1038/s41588-023-01458-z (2023).

7              Liu, Y. et al. Transcription shapes DNA replication initiation to preserve genome integrity. Genome Biol 22, 176, doi:10.1186/s13059-021-02390-3 (2021).

8              Petryk, N. et al. Replication landscape of the human genome. Nat Commun 7, 10208, doi:10.1038/ncomms10208 (2016).