2023年7月5日，北京大學趙進東院士課題組與高甯教授課題組以及中科院物理所翁羽翔研究員課題組在Nature Communications上發表了題為“Cryo-EM and femtosecond spectroscopic studies provide mechanistic insight into the energy transfer in CpcL-phycobilisomes”的研究論文。論文利用冷凍電鏡技術首次解析了集胞藻（Synechocystis sp. PCC 6803）CpcL藻膽體（Phycobilisomes，PBS）的高分辨結構，确定了藍細菌藻膽體中色素基團（bilin）的不同構象，結合超快光譜實驗首次确認了在能量吸收中起關鍵作用的bilin的構象并證實了它在能量傳遞中的作用。

藍細菌是最早将太陽能轉化為化學能的生物種群之一，是24億年前地球上氧氣含量上升的原因。藍細菌對光能的捕獲主要通過藻膽體完成，并将捕獲的光能傳遞給光系統II（Photosystem II, PSII）或者光系統I（Photosystem I, PSI）。藍細菌中的藻膽體存在兩種類型，CpcG-PBS和CpcL-PBS。CpcG-PBS由核心（Core）和外周杆（Rods）組成，外周杆通過連接蛋白CpcG附着在核心周圍。相比之下，CpcL-PBS具有更小的尺寸，隻包含一個外周杆，并不存在核心部分。CpcL-PBS通過連接蛋白CpcL與光合膜連接，與PSI相互作用并可以将吸收的能量傳遞給PSI。CpcL-PBS還參與NAD(P)H脫氫酶-CpcL-PBS-PSI（NDH-PBS-PSI）超複合物的形成，并對于環式電子傳遞（Cyclic electron transfer，CEF）不可缺少¹，同時CEF也需要鐵氧還蛋白-NADP⁺氧化還原酶（Ferredoxin-NADP⁺ oxidoreductase, FNR）和CpcL-PBS的相互作用²。FNR可以附着在CpcG-PBS或者CpcL-PBS的外周杆上，但是已經報道的CpcG-PBS的結構中并沒有發現FNR的存在。盡管對于CpcG-PBS的能量傳遞機制研究者在2021年已有報導³，但是對于CpcL-PBS向PSI的能量傳遞機制以及CpcL-PBS在NDH-PBS-PSI超複合物形成中的作用研究尚不清楚。

本研究利用冷凍電鏡技術解析了Synechocystis sp. PCC 6803的CpcL-PBS的高分辨結構。該結構顯示CpcL-PBS複合物主要組成形式為三層圓盤的垛堞結構（圖1a-c），每層圓盤的主體部分由CpcA和CpcB的異源六聚體組成，圓盤之間通過四種不同類型的連接蛋白（CpcL，CpcC1，CpcC2，FNR）連接起來，其組成類似于線性結構（圖1d,e）。CpcL-PBS與CpcG-PBS的外周杆很相似（圖1f）。在CpcL-PBS複合物中，CpcL靠近類囊體膜，而FNR則位于CpcL-PBS複合物的末端（圖1g），這也是首次在已解析的藻膽體結構中發現FNR蛋白。

圖1 Synechocystis 6803 CpcL-PBS複合物結構

盡管CpcL-PBS和CpcG-PBS的外周杆高度相似，但是CpcL-PBS在室溫熒光上有一個668納米的發射峰，這相比于CpcG-PBS外周杆的發射峰有一個相當明顯的紅移。之前對于遠紅外光适應物種的研究發現光的紅移可能和bilin的構象有關⁴。為了探明CpcL-PBS複合物紅移的原因以及CpcL-PBS是如何将能量傳遞給PSI的，研究者分析了CpcL-PBS複合物中bilin的構象。結構分析發現，CpcL-PBS複合物中的bilin的構象不盡相同，這種差異化的bilin主要集中分布在連接蛋白的周圍（圖2a,b）。在CpcG-PBS複合物的研究中，研究者已經報導了連接蛋白在能量傳遞中的作用³，通過CpcG和CpcL-PBS中對應位置bilin構象的比較，研究者發現bilin的差異化主要表現在bilin的Ring C和Ring D的變化上（圖2c,d）。而Ring C和Ring D是bilin和連接蛋白相互作用的區域，在CpcL-PBS和CpcG-PBS的外周杆中，這種bilin的差異性來源于bilin的Ring C和Ring D和連接蛋白CpcL或者CpcG相互作用的結果，表明連接蛋白可以調節bilin的能量狀态，從而使得bilin的能級和光譜存在不同。

圖2 CpcL-PBS中bilin的分布以及一些關鍵bilin的構象

為了進一步探究CpcL-PBS能量傳遞的動态特性，研究者采用超快光譜的方法去研究CpcL-PBS中激子的遷移（exciton migration）。之前對于藍細菌Synechocystis 6803⁵和Anabaena 7120 ⁶的CpcL-PBS到PSI能量傳遞的研究發現，CpcL-PBS中存在“red bilin”并且對于CpcL-PBS的能量傳遞非常重要。本研究采用飛秒時間分辨的瞬态吸收光譜（Femtosecond time-resolved transient absorption spectroscopy）研究完整的CpcL-PBS的光譜學性質（圖3a-c），結果顯示組分P1有3.6 ps的衰減時間（decay time），并且在631 nm處存在吸收漂白，在671 nm處存在一個正吸收峰。組分P2有40 ps的衰減時間，在637 nm處存在吸收漂白，在675 nm處存在一個正吸收峰。組分Rs和R_L有一個中等的衰減時間為200 ps，它們的吸收漂白分别在644 nm和668 nm處。最慢的組分T衰減時間大于1200 ps，并且在669 nm處存在吸收漂白（圖3c）。這些結果表明，CpcL-PBS的能量遷移發生在皮秒時間範圍内，并按照如下方式傳遞：

P₁(3.6ps)/ P₂(25ps) → R_S/R_L (200ps) → to T (>1200 ps)

圖3 CpcL-PBS的超快吸收和熒光光譜分析

研究者進一步采用皮秒時間分辨熒光光譜技術（Picosecond time-resolved fluorescence spectroscopy）研究CpcL-PBS的能量轉移（圖3d-f）。衰減相關譜（Decay-associated spectra, DAS）和成分相關譜（Species-associated spectra, SAS）如圖3d和3e所示，結果顯示有三種成分相關光譜，并且它們的衰減時間常數分别為101 ps，401 ps和1999 ps。時間常數為401 ps的SAS由兩個成分組成，一個峰值在651 nm，另一個峰值在669 nm（圖3e）。因此這些成分在能量轉移中的動力學如下所示：

C_645nm à C_651nm/C_669nm à C_672nm (C: component)

結合冷凍電鏡技術解析的CpcL-PBS的結構，作者推出了在CpcL-PBS中常規的bilin到“red bilin”的能量轉移過程。在飛秒時間分辨的瞬态吸收光譜中，組分P1應該為所有的bilin α⁸⁴ 和β¹⁵⁵，因為它們幾乎不與連接蛋白相互作用，預計有最短的漂白波長。組分P2在637 nm處有一個漂白峰，應該是除去最底部的三個bilin β⁸²剩下的所有的bilin β⁸²，它們位于六聚體的空腔内部，并且和連接蛋白相互作用。Rs和R_L分别被指定為bilin ^1Iβ⁸²₃和^1Iβ⁸²₁，它們具有相同的衰減常數（200 ps），但是R_L在668 nm有更明顯的紅移吸收漂白。這是因為相比于bilin ^1Iβ⁸²₃，bilin ^1Iβ⁸²₁和連接蛋白CpcL存在更多的相互作用，并且Ring C和Ring D之間的角度更小，平面性更強。組分T被分配為bilin ^1Iβ⁸²₂，它具有最強的平面性，是CpcL-PBS複合物中的“red bilin”，負責能量向PSI的傳遞。同樣的，在皮秒熒光光譜中，除了三個獨特的bilin ^1Iβ⁸²，所有的熒光發射合并為C₆₄₅ nm（100 ps），bilin ^1Iβ⁸²₃ (R_S)和bilin ^1Iβ⁸²₁ (R_L)的發射光譜為C_651nm/C_669nm (401 ps)，bilin ^1Iβ⁸² (T)的發射光譜為C_672nm (1999 ps)，這些結果清晰地表明CpcL-PBS含有終端發射的“red bilin”可以将能量直接傳遞給PSI。

綜上所述，本研究證明了FNR蛋白位于CpcL-PBS的最遠端，并且結合了飛秒瞬态吸收光譜和皮秒熒光光譜實驗證明了單個bilin在能量傳遞中的作用，同時揭示了bilin ^1Iβ⁸²₂作為“red bilin”是CpcL-PBS複合物中的能量陷阱，負責将能量傳遞給PSI。本研究對于理解其它類型藻膽體的能量傳遞機制提供了關鍵信息，也為捕光複合物中蛋白-色素的相互作用和高效的能量遷移研究提供了一個代表性的實驗體系。

beat365官方网站趙進東院士和高甯教授，以及中科院物理所研究員翁羽翔研究員為本文的共同通訊作者。鄭呂欽（高甯組），張正東（趙進東組），王宏蕊（趙進東組），鄭正高（趙進東組）為該研究論文的共同第一作者。本研究得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金委、生命科學聯合中心、膜生物學國家重點實驗室、蛋白質與植物基因研究國家重點實驗室和beat365官方网站啟東産業創新基金的經費支持，以及冷凍電鏡平台、北京大學電鏡實驗室、高性能計算中心、生科院儀器中心及鳳凰工程的技術支持。

文章鍊接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-39689-7

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