光照與溫度是調控植物生長發育的重要環境因子，由光敏色素B（phyB）作為受體感知。2022年鐘上威實驗室揭示了phyB通過光控蛋白質變構與溫控液液相分離，實現對光照與溫度兩種不同環境信号的同時感知（Molecular Cell 82, 3015-3029）。自上個世紀50年代科學家發現光敏色素以來，圍繞光敏色素的光激活、信号傳導、生理功能等多方面取得了諸多進展，是國際植物生物學最受關注的研究領域之一。在光敏色素的信号轉導中，有兩個關鍵發現尤為矚目。一個是Akira Nagatani實驗室發現了phyB的細胞核定位現象：土壤中萌發的幼苗處于黑暗環境，phyB在細胞質中大量積累；出土見光後，phyB快速轉入細胞核中行使功能。從細胞質向細胞核轉運的入核稱為phyB信号早期傳導的關鍵限速步驟。另一個是Peter Quail實驗室引領發現了phyB在細胞核内與轉錄因子PIFs直接互作，調控大量基因表達。自此，形成了廣為熟知的phyB-PIFs模型，光信号通路的主流研究集中到了phyB在細胞核内的生理生化功能，但是，光誘導的phyB入核機制至今仍不清楚。

2023年3月16日，北京大學鐘上威實驗室在Cell期刊發表了題為“Sensory circuitry controls cytosolic calcium-mediated phytochrome B phototransduction”的研究論文，報道植物通過“光-鈣調控環路”，快速激活兩個鈣依賴性蛋白激酶，在Ser80和Ser106位點磷酸化phyB，控制phyB入核。該工作同時提出了胞質第二信号鈣離子在受體層面解碼為特定轉導通路的新機制。

在動物視覺感知中，鈣離子作為第二信使參與了早期信号傳導。上世紀80、90年代，科學家們通過生化抑制劑、微量注射等實驗提示鈣信号可能參與早期phyB的信号轉導。但是由于抑制劑的非特異性影響、轉導通路不清晰以及缺乏直接遺傳證據，鈣離子是否參與植物光信号通路存在很大争議。本研究中，作者利用穩定遺傳的鈣指示轉基因植株，通過優化鈣信号活體成像技術，避免葉綠素原酯、葉綠素等自發熒光的成像幹擾，成功捕捉到在暗下生長的黃化苗見紅光後，出現一個快速的胞質鈣離子濃度上升信号，并通過紅光-遠紅光可逆轉換與遺傳學證據，确定紅光激發的胞質鈣信号是由phyB所特異介導的（圖1）。

圖1、紅光通過phyB特異激活植物細胞質鈣濃度升高。

暗下生長的黃化苗在處理前（Dark）與30秒紅光處理後（Red），通過活體成像檢測，發現紅光能快速上調胞質鈣濃度。當在紅光處理後緊接着處理遠紅光，紅光對胞質鈣濃度的調控作用被逆轉，暗示可能是由phyB介導（紅光-遠紅光可逆調控是phyB的蛋白特性）。進一步通過遺傳雜交，比較野生型（WT）和phyB突變體（phyB）,發現phyB突變體中紅光誘導的胞質鈣濃度被顯著降低，說明該過程主要由phyB所特異介導。

為了探究紅光激活的胞質鈣濃度升高是否具有生理功能，作者使用鈣離子抑制劑對黃化苗進行了預處理，發現光響應基因的表達調控被顯著抑制，說明鈣離子可能參與了細胞核内的光信号響應。作者進一步檢測了鈣離子抑制劑對phyB入核的影響，發現當胞質鈣離子信号被抑制後，光誘導的phyB入核被高度抑制，表明鈣信号參與調控phyB入核。植物具有比動物更為豐富的鈣結合蛋白解碼系統。作者通過蛋白質互作篩選，鑒定到兩個鈣依賴性蛋白激酶CPK6和CPK12（CPK6/12）。當胞質鈣濃度升高時，CPK6/12被激活，激活後的CPK6/12能特異識别紅光激活的phyB，發生直接互作。當CPK6/12沒有被鈣激活，或者phyB沒有被紅光激活時，CPK6/12都不能識别phyB。隻有在兩者分别被鈣和光同時激活的情況下，CPK6/12才能與phyB互作。CPK6/12識别phyB後，在phyB的Ser80和Ser106兩個位點進行磷酸化修飾，使得phyB能夠從細胞質轉入細胞核，進而調控核内轉錄因子降解與光響應基因表達，促進植物幼苗子葉的快速打開與擴展，使其适應出土後的環境進行光合自養生長。

本論文中，作者提供了全面深入的分子遺傳證據。在cpk6 cpk12雙缺突變體中，紅光誘導的phyB快速入核被顯著抑制，且在黃化苗暗轉紅光12小時後，仍呈現子葉閉合與子葉不擴展的表型缺陷，與phyB突變體相似。當在cpk6 cpk12雙缺突變體中轉入組成型入核的phyB（phyB加上組成型核定位序列NLS，phyB-NLS），則能夠完全恢複cpk6 cpk12雙缺突變體的表型缺陷，表明該表型缺陷是由于phyB不能入核所導緻。為了驗證被CPK6、12磷酸化的Ser80和Ser106位點的生物學意義，作者構建了這兩個位點磷酸化缺失的phyB-2A點突基因，與野生型phyB（phyB-WT）基因分别轉入phyB突變體植物。亞細胞定位結果顯示，黃化苗見光後，phyB-WT能快速入核，但phyB-2A不能入核（圖2）。表型結果顯示，phyB-2A幼苗在見光12小時後，子葉仍然保持閉合不擴展，呈現phyB突變體表型，而phyB-WT幼苗則正常發育。這些遺傳證據與分子生化結果相互印證，表明CPK6/12通過磷酸化phyB的Ser80和Ser106位點調控phyB入核。

圖2、Ser80和Ser106位點磷酸化是控制phyB入核的開關。

暗下生長的黃化苗在處理前（Dark）與2小時紅光處理後（Dark to Red），觀測phyB蛋白的亞細胞定位。結果顯示，黃化苗細胞質中大量積累的phyB-WT，在見光2小時内即快速轉入細胞核；當Ser80和Ser106位點被點突為磷酸化缺失的氨基酸後，phyB-2A蛋白不能入核。

此外，在種植轉基因植物材料時，作者發現phyB-2A植物除了在黃化苗暗轉光中出現發育缺陷，持續光照下，甚至在成年植株中都呈現phyB突變體表型，表明phyB-2A是一個沒有生理功能的phyB點突蛋白。為了探究phyB-2A的功能缺陷是僅由于其不能入核，還是因蛋白活性受損導緻，作者将phyB-2A加上NLS序列，使其定位于細胞核内。結果顯示，phyB-2A-NLS恢複了所有phyB的功能，與phyB-WT沒有區别，說明phyB-2A僅是影響了phyB入核，而蛋白的活性是正常的（圖3）。作者進一步檢測了cpk6 cpk12雙缺突變體在其他光照條件下的表型，結果顯示與phyB-2A的組成型入核缺陷不同，在cpk6 cpk12雙缺突變體的黃化苗中，随着紅光照射時間延長到24小時，phyB入核逐漸恢複。綜合這些遺傳結果，作者發現Ser80和Ser106位點磷酸化是控制phyB入核的廣譜開關，而CPK6/12特異調控黃化苗見光引起的快速響應。植物可能通過不同的磷酸化途徑來調控這兩個位點，以适應複雜多變的環境。在黃化苗出土見光時，通過胞質鈣濃度升高快速激活CPK6/12，介導胞質中大量積累的phyB在短時間内轉入細胞核，促進環境劇變時的發育轉變；而在長時間的穩定光照條件下，植物可能以其他激酶調控phyB的磷酸化與入核。

圖3、Ser80和Ser106位點磷酸化特異控制phyB入核，但不影響phyB蛋白活性。

持續紅光下生長的phyB-2A與phyB-9突變體表型相似，phyB-2A-NLS恢複正常生理功能，說明phyB-2A的功能缺失僅僅是由于其不能入核所導緻。

綜上所述，該研究發現紅光通過phyB特異觸發胞質鈣濃度升高，激活鈣依賴性蛋白激酶CPKs，被鈣激活後，CPKs反過來與紅光激活的phyB直接互作，磷酸化phyB使其入核，将紅光激活的鈣信号特異解碼為核内光響應基因表達（圖4）。先前研究發現，植物受到外界多種不同環境刺激時，比如鹽堿、幹旱、機械壓力、低溫以及蟲咬等，都會誘發胞質鈣濃度快速升高，激活鈣依賴性蛋白激酶，但卻最終産生與環境刺激相對應的特異生理響應。植物如何将通用的胞質鈣信号解碼成特異的生理響應一直是生物學關注的關鍵科學問題。該研究提出的“紅光-phyB-Ca²⁺-CPKs-phyB”的“光-鈣調控環路”中，CPKs-phyB元件需要光和鈣信号的同時激活才能引起phyB入核，使得胞質鈣濃度升高特異轉換為光信号傳導。在植物感知與響應環境變化中，環境信号受體是特異性最高的功能組分，該研究提出的“環境信号受體-鈣信号-環境信号受體”調控環路機制，為深入認識鈣信号的特異性解碼提供新見解。

圖4、出土幼苗通過“光-鈣調控環路”，控制phyB入核。

出土前暗下生長的植物幼苗在細胞質中積累大量phyB，出土見光後phyB被紅光激活，誘導胞質鈣濃度快速升高，激活鈣依賴性蛋白激酶CPK6/12，被鈣激活的CPK6/12特異識别光激活的phyB，在Ser80和Ser106位點磷酸化phyB，使得phyB轉變為能入核的形式，快速轉入細胞核内，調控核内轉錄因子降解與光響應基因表達，促進出土幼苗形态發育轉變。

beat365官方网站、現代農業研究院鐘上威研究員為該論文通訊作者，博士生趙晏、博士後施慧（現首都師範大學教授，PI）、已畢業博士潘穎為論文的并列第一作者，實驗室成員呂默含、楊芷萱和寇小霞對論文做出了重要貢獻。北京大學鄧興旺教授對該研究給予了大力支持。該研究得到了國家自然科學基金、蛋白質與植物基因研究國家重點實驗室、啟東-SLS創新基金和北京市屬高校高水平教師隊伍建設支持計劃的資助。特别感謝北京大學鳳凰工程儀器平台對本項目的技術支持。

鐘上威實驗室圍繞光敏色素phyB的信号感知與傳導發表了一系列工作，揭示了phyB“分子膠水”、“光解寡聚化”等調控新機制，為理解環境信号受體的功能模式提出了新的視角（Developmental Cell 39, 597-610；Developmental Cell 51, 78-88）。2022年，實驗室揭示了phyB光小體的液液相分離形成機制，phyB通過光控蛋白質變構與溫控液液相分離，實現對光照與溫度兩種不同環境信号的共感知機制（Molecular Cell 82, 3015-3029）。本研究曆經8年的努力探索，提出的“光-鈣調控環路”phyB入核調控機制，解決了領域内尚不清楚、存在争議的幾個關鍵問題，審稿人稱此項工作将“改變對光信号通路的現有認知”。

鐘上威實驗室緻力研究植物幼苗出土存活的分子調控機制，誠聘不同學科背景的副研究員、助理研究員和博士後。實驗室依托北大生命學院與現代農業研究院，将提供有競争力的實驗條件和個人待遇，歡迎聯系。

原文鍊接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)00128-9